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尽管蛋白质结构复杂,包括20种不同氨基酸的组成和序列,但只有少数蛋白质官能团可作为实际生物偶联方法的可选择靶标。事实上,绝大多数 交联 和化学 修饰 技术都涉及到仅四个蛋白质化学靶点:
蛋白质功能组目标位于代表性蛋白质上。该图描绘了免疫球蛋白 (IgG) 的一般结构。 重链和轻链通过非共价相互作用和共价链间二硫键结合在一起,形成双侧对称结构。H 链和 L 链的 V 区构成免疫球蛋白 (Ig) 分子的抗原结合位点。每个 Ig 单体含有两个抗原结合位点,因此被称为二价的。铰链区域是 H 链在第一和第二 C 区域域之间的区域,由二硫键连接在一起。这种灵活的铰链 (可在 IgG , IgA 和 IgD 中发现,但不包括 IgM 或 IgE) 区域,允许两个抗原结合位点之间的距离会不同。图中还显示了几个功能基团,它们是实际生物偶联的可选目标。
对于这些蛋白质功能基团靶标,存在一到几种能够针对它们的反应基团,这些基团已被用作合成交联和修饰试剂的基础。
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许多化学反应基团已经过表征,并用于靶向主要类型的蛋白质官能团。当两个或更多这些反应性基团的不同组合结合到一个分子时,可以合成许多不同的交联试剂。当与不同尺寸和类型的化学"骨架"(因其定义了各自反应端之间的距离,故称为间隔臂)结合时,可交联化合物的数量是巨大的。
反应性类别 | 化学基团 |
羧基到胺反应基团 | 碳二亚胺 (例如 EDC) |
胺反应基团 | NHS 酯 亚氨酸酯 五氟苯基酯 羟甲基膦 |
巯基反应基团 | 马来酰亚胺 卤乙酰(溴基或碘基) 吡啶二硫化物 硫代硫酸盐 乙烯砜 |
醛反应基团 即氧化糖 (羰基) | 酰肼 烷氧基胺 |
光反应基团 即非选择性、随机插入 | 二氮杂环己烷 芳香叠氮化物 |
羟基 (非水性) 反应性基团 | 异氰酸盐 |
用于蛋白质偶联的常见交联剂反应基团。反应性类别标题链接至本文的特定部分。本条未具体讨论斜体化学品组名称。
Greg T. Hermanson 的《生物偶联技术,第三 版》(2013)是对一本公认生物偶联领域权威参考指南的全面更新。
《生物偶联技术》是一本完整的教科书和实验手册,适用于希望学习和掌握生物分子交联、标记和固定技术的生命科学家,这些技术是许多实验室应用的基础。对于希望为全新应用开发新型交联交联策略的研究人员而言,这本书也可以作为详尽而强大的参考指南。书中还包含生物共轭领域的广泛介绍,涵盖了不同学科中该技术的所有主要应用,以及为任何目的设计最佳生物共轭体的技巧。
根据交联剂的化学反应性(即特定官能团的特性)和其他影响其在不同应用中的表现的化学性质来选择交联剂:
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交联剂可归类为同型双功能或异型双功能。
同型双功能交联剂在间隔臂的两端有相同的反应基团,通常必须在一步反应程序中使用,以随机 "固定" 或聚合含有类似官能团的分子。例如,在细胞裂解液中添加胺基交联剂,会导致蛋白质亚基、相互作用蛋白以及任何其他多肽的随机共轭,这些多肽的赖氨酸侧链在溶液中恰好彼此靠近。这种方法非常适合捕捉所有蛋白质相互作用的"快照",但无法提供其他类型的交联应用所需的精度。例如,在制备抗体-酶偶联物时,目标是将一个酶分子与抗体分子连接,同时不形成抗体-抗体之间的连接。使用同二官能交联剂则无法实现这一目标。
同二官能交联剂示例。 DSS 是一种常用的简单交联剂,其短间隔臂的两端具有相同的胺反应性NHS酯基。间隔臂的长度(11.4 埃)是共轭分子(即目标胺的氮原子)之间的最大分子间距。
异二官能团交联剂的两端具有不同的反应基团。这些试剂不仅能够一步完成具有各自目标官能团的分子的共轭,而且能够进行顺序(两步)共轭,从而最大限度地减少不希望的聚合或自共轭。在顺序反应中,异二官能团试剂首先使用交联剂中最不稳定的基团与一种蛋白质反应。去除多余的未反应交联剂后,将经过修饰的第一种蛋白质加入到含有第二种蛋白质的溶液中,通过第二种反应性基团发生反应。最广泛使用的杂二官能交联剂是一端具有氨基反应性琥珀酰亚胺酯(即 NHS 酯),另一端具有巯基反应性基团(如马来酰亚胺)。由于 NHS- 酯基团在水溶液中稳定性较低,所以通常首先与一种蛋白发生反应。如果第二种蛋白没有可用的天然巯基,可使用巯基加成试剂在单独的预先步骤中添加。
异型双功能交联剂示例。Sulfo-SMCC 是一种常见的交联剂,一端有一个胺反应性 sulfo-NHS 酯基团 (左) 和巯基反应性马来酰亚胺基团 (右) ,位于环己烷间隔臂的另一端。这允许采用顺序的两步偶联程序。
在许多应用中,有必要保持蛋白质复合物的天然结构,因此交联通常在接近生理的条件下进行。反应中交联剂与蛋白质的最佳摩尔比必须通过实验确定,尽管个别试剂的产品说明书通常包含常见应用的指南和建议。
根据应用的不同,共轭程度是一个重要因素。例如,在制备免疫原共轭物时,需要较高的共轭程度来增加抗原的免疫原性。然而,当与抗体或酶结合时,低度至中度的结合可能是最佳选择,这样可保留蛋白质的生物活性。
蛋白质表面官能团的数目也是需要考虑的重要因素。如果目标基团数量众多,则可使用较低的交联剂与蛋白质的比例。对于数量有限的潜在目标,可能需要较高的交联剂与蛋白质的比例。此外,组件数量应保持在较低水平或最低水平,因为由两个以上组件组成的共轭物难以分析,且提供的蛋白质亚基空间排列信息较少。
继续阅读:抗体制备(免疫原制备)
EDC 和其他碳二亚胺是零长度交联剂;它们使羧酸(–COOH)与伯胺(–NH2)直接结合,但不成为目标分子之间最终交联(酰胺键)的一部分。
EDC 和其他碳二亚胺是零长度交联剂;它们使羧酸(–COOH)与伯胺(–NH2)直接结合,但不成为目标分子之间最终交联(酰胺键)的一部分。
EDC 交联反应必须在没有外来羧基和胺的条件下进行。酸性(pH 4.5 至 5.5)MES 缓冲液(4-吗啉乙磺酸)效果最佳,但 pH ≤ 7.2 的磷酸盐缓冲液也能与反应化学相容。N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)或其水溶性类似物(磺基-NHS)通常包含在EDC偶联方案中,以提高效率或产生更稳定、与胺反应的中间体(见下一节)。
由于肽和蛋白质含有多个羧基和胺,直接通过EDC介导的交联通常会导致多肽的随机聚合。然而,这种反应化学方法被广泛用于固定程序 (例如将蛋白连接至羧基修饰表面) 和免疫原制备 (例如将小肽连接到大型载体蛋白上)。
NHS 酯是由 EDC 活化的羧酸分子形成的反应基团(见前文)。NHS 酯活化的交联剂和标记化合物在弱碱性条件下(pH 7.2-8.5)与伯胺反应,生成稳定的酰胺键。反应释放出 N-羟基琥珀酰亚胺(MW 115 kDa),可通过透析或脱盐轻松去除。
NHS-酯交联反应通常在 pH 7-9.0 的磷酸盐缓冲液中进行,反应时间为 0.5 至 4 小时,反应温度为室温或 4°C。由于它们会争夺反应,因此不兼容三羟甲基氨基甲烷(TBS)等伯胺缓冲液;然而,在某些程序中,在偶联程序结束时添加三羟甲基氨基甲烷或甘氨酸缓冲液以终止反应是有用的。
磺基-NHS酯与 NHS 酯完全相同,只是 N-羟基琥珀酰亚胺环上含有一个磺酸基(–SO3)。这个带电基团对化学反应没有影响,但确实会增加含有该基团的交联剂的水溶性 。此外,带电基团可防止磺基-NHS 交联剂渗透细胞膜,使其可用于细胞表面交联方法。
咪唑酯交联剂与伯胺反应形成脒键。为了确保伯胺的特异性,咪唑酯反应最好在无胺、碱性条件下(pH 10)进行,例如硼酸盐缓冲液。
由于生成的脒键是质子化的,交联在生理 pH 下具有正电荷,与被取代的伯胺非常相似。因此,已将亚氨酸酯交联剂用于研究膜中的蛋白结构和分子关联,并将蛋白固定在固相支持物上,同时保留天然蛋白的等电点 (pI)。虽然亚胺酯仍用于某些程序中,但在高pH值下形成的亚胺键是可逆的。因此,在大多数应用中,更稳定、更高效的NHS-酯交联剂已逐渐取代了它们。
马来酰亚胺活化的交联剂和标记试剂在接近中性的条件下(pH 6.5-7.5)与巯基(-SH)发生特异性反应,形成稳定的硫醚键。蛋白质结构中的二硫键(例如,半胱氨酸之间的二硫键)必须还原为游离硫醇(巯基),才能与马来酰亚胺试剂发生反应。马来酰亚胺反应缓冲液中必须排除外来硫醇(大多数还原剂),因为它们会与偶联位点发生竞争。
短链同双官能团马来酰亚胺交联剂可使蛋白质结构中的二硫键转化为半胱氨酸之间永久且不可还原的连接。更常见的是,马来酰亚胺化学与胺反应NHS-酯化学结合使用,形成异双官能团交联剂,从而实现纯化肽和/或蛋白质的受控两步共轭。
大多数卤乙酰交联剂含有碘乙酰或溴乙酰基团。卤代乙酰基在生理至碱性条件下(pH 7.2 至 9)与巯基反应,形成稳定的硫醚键。为限制游离碘的产生(游离碘可能与酪氨酸、组氨酸和色氨酸残基发生反应),应在黑暗中进行碘乙酰基反应。
吡啶二硫醚可在广泛的pH值范围内与巯基反应,形成二硫键。因此,使用这些交联剂制备的共轭物可用典型的二硫键还原剂(如二硫苏糖醇(DTT))进行裂解。
在反应过程中,目标分子的 -SH 基团与交联剂的 2-吡啶二硫醇基团之间会发生二硫键交换。吡啶-2-硫酮(分子量=111 kDa; λmax = 343 nm)作为副产物释放出来,可通过分光光度法监测,并通过透析或脱盐从蛋白质结合物中去除。
羰基(醛和酮)可通过使用 偏过氧化钠对某些糖二醇进行温和氧化,在糖蛋白和其他含多糖的分子中产生。酰肼活化的交联剂和标记化合物将在 pH 5 至 7 时与这些羰基结合,形成腙键。
酰肼化物化学可用于通过糖基化位点对糖蛋白进行标记、固定或结合,这些位点通常(如大多数多克隆抗体)位于远离关键结合位点的区域,而人们希望保留关键结合位点的功能。
虽然目前不如酰肼试剂流行和常见,但烷氧基胺化合物与羰基(醛和酮)结合的方式与酰肼类似。
光反应试剂是化学惰性化合物,在紫外光或可见光照射下会变得活跃。一直以来,芳基叠氮化物(也称为苯基叠氮化物)都是交联和标记试剂中最常用的光反应化学基团。
芳基叠氮化合物在紫外光照射下会形成亚硝基,从而引发与双键的加成反应,或插入 C-H 和 N-H 位点,或发生环扩张反应,与亲核试剂(如伯胺)发生反应。反应可在多种不含胺的缓冲条件下进行,以结合蛋白质或甚至不含常见官能团的"手柄"的分子。
光反应试剂最常被用作异二官能团交联剂,用于捕获结合伴侣的相互作用。使用胺或巯基反应性末端,用交联剂标记纯化的诱饵蛋白。然后将标记的蛋白添加到裂解液样品中,使其与相互作用物结合。最后,用紫外线光进行光活化,通过苯基叠氮基引发共轭反应。
二氮杂环是较新的光活化化学基团,被用于交联和标记试剂。二氮杂环(氮杂戊酸)部分比苯基叠氮基具有更好的光稳定性,并且更容易、更有效地被长波紫外线(330-370 nm)激活。
二氮杂环的光活化会产生反应性炔中间体。这种中间体可以通过与任何氨基酸侧链或肽主链的加成反应形成共价键,其距离与特定试剂的间隔臂长度相对应。氨基酸的二氮杂环庚烷类似物可以通过翻译整合到蛋白质结构中,从而激活特定的重组蛋白作为交联剂。
以下代表性示例展示了细胞内蛋白质复合物与SDA试剂的光反应交联。在人类宫颈癌细胞系HeLa中研究了早期内体抗原1(EEA1)蛋白的相互作用。EEA1 通过螺旋线圈结构形成同源二聚体,与磷脂囊泡结合,并参与内体运输。
使用 NHS-二氮杂环丙烷交联剂捕获并检测细胞内蛋白质的同二聚体。将 HeLa 细胞与各种 NHS-二氮杂环丙烷衍生物一起培养,并用紫外线照射。然后,使用抗 EEA1 抗体对细胞进行裂解,并通过 SDS-PAGE 和蛋白质印迹进行分析。在紫外线照射后,仅在使用 SDA 和 SDAD 处理的样品中观察到了 EEA1 的移动性降低,而在未处理的对照样品中则没有观察到。由于 EEA1 是一种细胞内蛋白质复合物,它不会被 Sulfo-SDA 交联,因为后者无法穿透细胞膜。此外,移动速度较慢的、经 SDAD 交联的 EEA1 可以用还原剂二硫苏糖醇(DTT)在间隔区进行裂解。使用 GAPDH 检测来确认蛋白质的加载量是否相等。
化学选择性结合是指使用相互特异性的共轭试剂对。与生物研究中常用的典型交联方法不同,这种反应化学依赖于一对独特的反应基团,它们彼此专一,且与生物系统无关。由于这些反应(叠氮-炔或叠氮-膦)不会在细胞中发生,因此这些官能团仅在生物样品中相互反应,从而产生最小的背景和很少的伪影,因此被称为“化学选择性”。这这种特殊形式的交联可应用于体内代谢标记和使用生物正交偶联伙伴的生物共轭。
使用铜催化剂或无铜的紧张炔烃,在叠氮和炔烃之间发生反应,在偶联伙伴之间形成稳定的三唑键。由于两个偶联伙伴的生物正交性质,这种反应引起了人们的广泛关注。在经典的点击反应中,叠氮化物通过 Cu(I) 与炔烃偶联,将两个偶联物结合在一起,形成稳定的三唑键。这种方法的一个缺点是铜离子(包括 Cu(II)和 Cu(I),后者在抗坏血酸盐或 TCEP 存在时产生)会损害细胞,降低荧光团的荧光,并损害蛋白质的功能。为了克服这一挑战,人们开发了应变环炔(DIBO/DBCO),使其能够在生物条件下在没有铜的情况下与叠氮反应,形成三唑键。这种八元环中的应变使得在无催化剂或极端温度下与叠氮化修饰分子发生反应成为可能,从而能够研究活细胞表面,并防止铜对固定和渗透细胞中GFP等荧光蛋白的损伤。
施陶丁格反应发生在甲基膦(PH3)和叠氮化物(N3–)之间,生成氮杂亚基中间体,该中间体被捕获以形成稳定的共价键。与点击化学类似,该连接反应具有高度的特异性,可在生理 pH 值的水环境中进行。Staudinger 键合不需要铜发生反应。虽然这提高了施陶丁格键合的生物相容性,但由于没有催化剂,这些反应的速度往往比点击反应慢。
继续阅读:化学选择性连接反应化学
继续阅读:代谢标记策略
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