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蛋白质结构质谱分析
对于蛋白质，构型即功能。为了了解蛋白质的功能和作用机理，必须确定蛋白质复合体的组件和结构。我们通过整合结构生物学解决方案在加速蛋白质结构-功能研究方面处于领先地位，这些解决方案汇集了质谱和低温电子显微镜 (cryo-EM) 等互补技术。这些解决方案可以共同解析大型动态复合体的结构。
本页内容
整合结构生物学宣传页
下载标题为“从结构到功能的更高精度 3D 分析”的全新整合结构生物学宣传页，其中重点介绍了如何将各种质谱 (MS) 技术与冷冻 EM 相结合，以提供超越蛋白质结构的独特见解。该宣传页概述了质谱与冷冻电镜相结合的各种机会，有助于研究人员超越结构本身并了解蛋白质的功能。它进一步比较了冷冻电镜和 MS 组合工作流程中讨论的所有技术的优势，无论是用于筛选、解析结构还是理解蛋白质功能。
应用 MS 技术研究蛋白质结构和功能
质谱技术的发展已经在单个蛋白质水平和蛋白质复合体水平产生了若干结构生物学应用。质谱技术的主要优点是能够在蛋白质组层面上开展实验，在天然生物状态下分析蛋白质，还能减少所需的极小样品量。
利用 MS 确定蛋白质结构
质谱分析 (MS) 常用于测定蛋白质的一级和高级结构。MS 技术的新进展，结合化学改性和蛋白质水解策略，实现了对单一蛋白质和蛋白质复合体的研究，并有助于进一步探索蛋白质结构乃至结构动力学。
Thermo Scientific Orbitrap MS 解决方案提供了具有高度特异性和灵敏度的工作流程，使您能够进一步深入分析样品，并传递信息以加快从结构到功能的进程。
使用自下而上的方法进行质谱多肽测序是获取蛋白质一级结构相关信息的实用且简单的途径。这些信息有助于解析相应蛋白质的特征，甚至是大型蛋白质复合体中多个蛋白质的特征。
氢氘交换质谱法 (HDX-MS) 可检测蛋白质复合体中蛋白质的构象变化或蛋白质-蛋白质相互作用。分子间或分子内紧密接触区域内的酰胺质子通常形成氢键，而且其交换速率有别于复合体中更容易接近的区域。通过监测这种交换，可以更好地了解蛋白质的非共价结构（单独或复合体中）。
对单个蛋白质应用限制性蛋白酶解法，结合 MS，可得出有关蛋白质高级结构及其折叠状态的结论。该方法也可用于研究蛋白质复合体的四级结构。蛋白质与其他大分子之间形成的界面将保护其他可接近位点不被蛋白酶分解，从而有助于了解形成该界面的残基。
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蛋白相互作用决定其功能
蛋白质与小分子的相互作用被称为蛋白质-配基相互作用，涉及许多生物学功能，从蛋白质转录到翻译和信号转导。了解小分子结合引起的构象变化，以及哪些分子能比其自身天然配基更好地结合目标蛋白，是生物治疗设计的关键目标。
有关蛋白质-配基复合体相互作用的信息，如化学计量和离解常数，往往是通过质谱分析获得的。在非变性生物学状态下使用质谱仪分析蛋白质-配基复合体。复合体质量测量可证实是否存在蛋白质-配基相互作用，而化学计量则是在有或无蛋白质-配基相互作用的情况下通过质量测量来测定。
氢氘交换质谱法 (HDX-MS) 有助于确定蛋白质-配基相互作用的位点。将蛋白质-配基复合体溶解在 D2O 溶液中，使蛋白质的不稳定酰胺质子与氘进行交换。一般来说，蛋白质-配基相互作用区域的交换速率远远慢于暴露于 D2O 的开放区域。然后用质谱仪测定质子交换速率，帮助定位相互作用位点并解析其结构信息。
交联质谱分析 (XL-MS) 用于确定蛋白质-配基结合位点。此过程一开始先对光交联蛋白质及配基应用光亲和标记。然后富集、酶解样品，并用质谱仪分析样品以鉴定蛋白质上的配基修饰。
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利用质谱法测量蛋白质
许多细胞过程均由数量精确的特定蛋白质复合体、配基或酶来调节。蛋白质化学计量学的目的是测量这些蛋白质复合体中各个成分的确切数量，这是全面了解其整体功能所必需的。
多肽 MS 定量方法可用于测定蛋白质复合体中的蛋白质化学计量，这是解析蛋白质复合体结构的第一步。也可以加入靶向方法（采用数量已知的相关蛋白质/多肽同位素标记标准品），以便准确测量这些蛋白质复合体。
在非变性生物状态下直接引入蛋白质复合体，实现了蛋白质-蛋白质和蛋白质-配基复合体分析。质量测量与蛋白质鉴定相结合，可确认这些复合体的精确化学计量。这些信息是蛋白质复合体结构测定至关重要的第一步。
交联质谱分析 (XL-MS) 可用于测定单个蛋白质复合体的结合化学计量。这在处理不稳定蛋白质和蛋白质复合体时极为有利。通常使用零长度或非特异性交联剂来保存相互作用伴体，以便测量蛋白质化学计量。
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蛋白质活性与相互作用的关系
蛋白质的生物活性取决于它与其他蛋白质的相互作用。蛋白质－蛋白质相互作用控制蛋白质修饰、转运、折叠、信号传导和细胞周期等细胞过程。为了全面了解蛋白质的功能，应在蛋白质与其他蛋白质相互作用的背景下对其进行研究。
非变性质谱分析 (MS) 在生成蛋白质-蛋白质相互作用信息、确认蛋白质特征以及解释异质性数据等方面起着至关重要的作用。蛋白质复合体引入质谱仪时进行的溶剂处理可揭示更多信息。例如，改变溶剂酸碱度或添加有机添加剂可以分离蛋白质复合体亚基，然后将其裂解以确认特征。非变性质谱分析还可以提供蛋白质-蛋白质相互作用相关蛋白质的化学计量信息。
在交联质谱分析 (XL-MS) 中，化学交联剂用于连接相互作用配基的组分，以保持其原有的相互作用。然后使用自下而上蛋白质组学 MS 方法。XL-MS 的一个优点是只需要很小的样品量就能直接在蛋白质组水平进行分析。XL-MS 还能在生物体的生理状态下检测蛋白质相互作用，生成有生物学意义的信息。
氢氘交换质谱法 (HDX-MS) 有助于确定蛋白质-蛋白质相互作用的位点。一般来说，与直接暴露于 D2O 的区域相比，蛋白质-蛋白质相互作用区域减缓了酰胺质子与 D2O 之间的交换速率。鉴于这种差异，蛋白质-蛋白质相互作用位点可通过质子交换来定位。然后由质谱分析来确定这些位点。HDX 蛋白质实验通常是在符合蛋白质天然生物状态的实验条件下进行的。
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质谱分析在蛋白质鉴定中的应用
不管问题如何，蛋白质组学的主体是蛋白质鉴定。在当前的实验室实践中，蛋白质鉴定和质谱分析 (MS) 几乎相依而存，因为 MS 可对复杂程度不一的任何样品进行高通量蛋白质定量分析。借助 MS，就可以在完整（自上而下）蛋白质水平或使用更受欢迎的策略（自下而上蛋白质组学）鉴定蛋白质。在后一种策略中，蛋白质被酶解消化为其多肽成分，然后在多肽水平进行分析。
液相色谱串联质谱 (LC-MS/MS) 是大多数研究人员进行蛋白质鉴定的主要工作流程。蛋白质被酶解消化为多肽成分，然后使用 LC-MS/MS 进行分析。产生的序列数据用于确定样品的原始蛋白质成分。对于单个蛋白质，序列通常用来确认其特征。当涉及蛋白质复合体时，这种自上而下的蛋白质组学方法将确定构成复合体的各个蛋白质。
蛋白质鉴定可在完整蛋白质水平使用气相裂解技术来实现，而无需预先酶解。这种方法可以定位翻译后修饰 (PTM) 组合，提高单个蛋白质的序列覆盖率，还可以表征蛋白质组。这类实验还可提供降解产物和序列变异等其他信息。
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通过质谱分析了解蛋白质的变化
大多数蛋白质会在其氨基酸残基上进行一定程度的翻译后修饰 (PTM)，从而影响其在催化、细胞信号转导和降解等过程中的生物学功能。标测单个蛋白质亚单位上的 PTM 位点有助于了解亚单位的功能和调节。对于蛋白质复合体，定位后的 PTM 也可以帮助预测其伴体蛋白质的相互作用。
液相色谱串联质谱法 (LC-MS/MS) 是最常用于识别和定位蛋白质和蛋白质复合体上 PTM 的方法。在自下而上 PTM 工作流程中，通常会采用多种裂解方法来确保全面表征蛋白质。
自中而下游蛋白质组学（蛋白质结构低分辨率研究）涉及限制性蛋白酶解。这种方法可覆盖大型天然构形肽段的序列，有利于表征蛋白质-蛋白质相互作用或在蛋白质重建工作中为结晶研究探测不稳定区域。
自上而下质谱分析的主要优点是能够识别和定位 PTM 组合。利用这种方法，无需预先酶解相关肽类即可分析蛋白质。自上而下质谱分析可能涉及复杂混合物中的单个或多个蛋白质。这些实验通常还提供降解产物和序列变异等其他信息。
非变性质谱分析用于确定蛋白质上 PTM 的预期模式和程度。它还可以提供有关特定位点修饰（例如糖型）的相对丰度信息。鉴于附加 PTM 固有的异质性和变异性，通常使用高分辨精确质量数质谱法来执行非变性质谱分析。
HDX-MS 可用于研究化学修饰引起的蛋白质构象变化。在 HDX 实验中，会比较未修饰蛋白质和修饰蛋白质的氘交换速率。通过监测氘摄取情况，可获知修饰如何影响所研究的蛋白质。
特定配基可以化学方式结合到固体载体上，使某些类型的生物分子根据其化学亲和力得到富集。示例分子包括磷酸盐、糖基和泛素基团。通过使用结合配基，特异性 PTM 和多肽被亲和纯化，并最终用于 MS 分析。
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应用于蛋白质结构分析的 MS 工作流程和推荐产品
助您突破当前科研成果
从蛋白质组全谱分析和定量、结构表征到多通路单细胞蛋白质组学，帮助您获取错综复杂的分子和生物系统的深入洞察信息。借助新型创新技术在实验范围内提供极大的灵活性，Thermo Scientific Orbitrap Eclipse Tribrid 质谱仪助您更快速地获取有影响力的结果，从而进一步突破当前科研成果。
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应用于完整、精确的 3D 结构测定的整合结构生物学
解决大型动态复合体的结构问题需要整合多种互补技术，如质谱和低温电镜密度图，这种方法被称为整合结构生物学。
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质谱学的进展与低温电镜样品制备、数据采集和图像处理的最新发展相结合，能够解析由蛋白质、翻译后蛋白质修饰、DNA、RNA 和脂质等成分组成的大分子复合物的可靠、完整的结构。冷冻电镜，尤其是单颗粒分析 (SPA)，正在成为必不可少的病毒和蛋白质复合物结构测定技术。
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生物分子质谱技术大幅推进了结构生物学领域的发展，并对其有着显著影响。在完整蛋白质水平，非变性质谱能通过非共价蛋白质-蛋白质和蛋白质-配基复合体分析来研究天然状态下的蛋白质组件。在多肽水平，蛋白质水解消化物 LC-MS/MS 分析有助于确定蛋白质的氨基酸序列，并能从蛋白质组数据库中识别其亚单位。
Thermo Scientific Orbitrap MS 解决方案兼具以多肽为中心和以蛋白质为中心的策略，有助于深入了解一系列生物化学和结构特性。有了成熟 HRAM Orbitrap 系统提供的高质量数据，您便可以自信地深入分析样品，并传递信息以加快从结构到功能的进程。
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我们邀请您下载这本由 Science 杂志编辑合著的综合性手册，其中包括来自 Science 杂志系列的文章、关于整合结构生物学的观点以及主要研究人员访谈。
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我们将介绍如何制备在化学计量意义上定义明确的 KaiCB 和 KaiCBA 组件（由非变性质谱监测），从而实现通过单粒子低温电子显微镜和质谱分析进行结构表征。
参考文献
- Snijder, J., Schuller, J.M., Wiegard, A., Lössl, P., Schmelling, N., Axmann, I.M., Plitzko, J.M., Förster, F. and Heck, A.J., 2017.
在完全组装状态下冷冻的蓝藻昼夜节律振荡器的结构.
Science, 355(6330), pp.1181-1184.