巨噬细胞概述

巨噬细胞是天然免疫系统特化的，存活时间长，具有吞噬作用的细胞。它们与中性粒细胞一起，是感染的第一反应者[1]。巨噬细胞参与细胞碎片和病原体的识别、吞噬和降解[2]。巨噬细胞还在向T细胞提呈抗原以及诱导其他抗原呈递细胞表达共刺激分子等方面发挥作用，从而启动适应性免疫反应[1]。此外，在炎症初期，它们通过释放细胞因子和趋化因子发挥重要作用，这些细胞因子和趋化因子反过来将其他免疫细胞募集到炎症部位[3]。

巨噬细胞的主要功能

巨噬细胞存在于大部分组织中，因此具有不同的功能。除了能启动对病原体的免疫反应和炎症反应，巨噬细胞还维持组织稳态以及组织的修复和重塑发挥作用[4] [5]。不幸的是，这种功能与许多疾病有关，包括代谢和自身免疫性疾病、癌症、感染、肥胖和纤维化[5] [6]。因此，巨噬细胞似乎在肿瘤微环境中也起着关键作用，特别是在基质重塑、血管生成、转移和肿瘤进展中[5]。

巨噬细胞的来源很多。驻留在组织中的巨噬细胞可以从循环单核细胞中分化出来，循环单核细胞由骨髓中的造血干细胞发育而来，也可以在胚胎发育过程中在胎肝、卵黄囊或背主动脉附近的胚胎区域生成，因此在成年期独立于单核细胞而存在[3] [5] [6]。前一种发育是通过单核细胞在稳定状态下或炎症时迁移到组织中实现的，随后分化为持续性的组织特异巨噬细胞，包括骨巨噬细胞（破骨细胞）、中枢神经系统（小胶质细胞）、结缔组织（组织细胞）和肝脏（库普弗细胞），以及肺泡巨噬细胞（噬尘细胞）、肠、脾和腹膜[7]。小胶质细胞和库普弗细胞能够在存在白细胞介素34 （IL-34）的情况下自我更新，IL-34表达于这些组织，并与巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）的受体结合[3]。由于它们分布和作用于多种不同组织和器官中，因此巨噬细胞具有多种形态和表型[5]。

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巨噬细胞是除粒细胞（嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞）和树突状细胞（DC）之外的三种吞噬细胞类型之一。微生物一旦进入宿主并开始复制，这些吞噬细胞中的一种就会将其识别并吞噬破坏，这一过程称为吞噬作用。大多数病原体通过呼吸系统、肠粘膜、皮肤损伤或泌尿生殖道进入宿主。由于巨噬细胞聚集在粘膜下层组织中，它们通常是第一个遇到病原体的防御细胞。当某些吞噬细胞受体（通常是病原体特有的碳水化合物或脂质结构）与病原体表面相互作用时，吞噬作用就开始了[3]。

在第一次相互作用后，吞噬细胞质膜将病原体包围并内化在一个被称为吞噬体的大膜包裹的内吞囊泡中。然后吞噬体与一个或多个溶酶体融合，形成吞噬溶酶体，溶酶体是含有抗菌肽和酶的小囊泡。溶酶体内容物被释放到吞噬溶酶体中，吞噬溶酶体反过来经历酸化和酶促过程，生成高活性的一氧化氮和超氧化物自由基来杀死病原体[3]。

关于吞噬细胞受体的两个例子是Dectin-1和甘露糖受体(CD206)。两者都是C型凝集素样家族的成员。Dectin-1由巨噬细胞和中性粒细胞表达，并与真菌细胞壁中常见的葡萄糖聚合物结合。CD206由巨噬细胞和DC表达，并与真菌、细菌和病毒共有的多种甘露糖基化配体结合[3]。

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巨噬细胞的分类仍然是一个非常有争议的话题，不同的因素会导致不同的表型和巨噬细胞活化状态，包括信号分子、生长因子、转录因子、表观遗传和转录后机制和变化，以及小生境信号，如细胞因子、细胞间接触物和代谢物[5] [8] [9]。此外，面对微生物及其产物，如脂多糖（LPS）[10]，巨噬细胞可以调节自身的活化状态。然而，巨噬细胞的活化在组织稳态以及炎症和疾病进展中起着至关重要的作用[5]。一般来说，巨噬细胞可以根据其功能和活化作用进行分类，并分为两种亚型：经典活化的M1巨噬细胞和替代活化的M2巨噬细胞。

M1巨噬细胞主要通过天然和适应性免疫反应在Th1细胞募集、病原体抵抗和肿瘤控制中发挥作用[13]。M1巨噬细胞通常由病原体、LPS、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）和1型辅助性T （Th1）细胞因子干扰素γ（IFN-γ）活化。许多通路能促进巨噬细胞向M1极化，，包括IRF/STAT、LPS/TLR4和NF-κB/PI-3激酶通路[14]。

从特征上说，M1巨噬细胞抗原呈递活性强和分泌促炎细胞因子多，如白细胞介素1 （IL-1）、IL-6、TNF-α、一氧化氮（NO）和活性氧（ROS） [12]。此外，它们下调IL-12和IL-23和IL-10的表达[13] [5]。M1巨噬细胞的刺激导致 IL-1b、TNF-α、IL-12、IL-18和IL-23的分泌水平提高。此外，M1巨噬细胞表型表达高水平的主要组织相容性复合体II类（MHC II）、CD68、CD80和CD86，以及针对Th1细胞的趋化因子，包括CXCL9和CXCL12 [12]。

表 1.人M1巨噬细胞标志物。这些标志物可用于区分M1巨噬细胞和其他细胞类型。

表 2.小鼠M1巨噬细胞标志物。这些标志物可用于区分M1巨噬细胞和其他细胞类型。

M2巨噬细胞可由寄生虫或真菌感染、免疫复合物、凋亡细胞、巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）、IL-13、TGF-b和2型辅助性T细胞因子 （Th2）IL-4、IL-33和IL-25通过Th2细胞替代活化[12] [15]。促进巨噬细胞进入M2状态的潜在信号包括STAT6、IRF4、PPARδ和PPARγ [11]。

与经典活化亚型相反，替代活化的亚型表达相反的表达谱：下调IL-12和IL-23，上调IL-10和IL-1RA [13] [5]。此外，M2巨噬细胞表达较低的炎症细胞因子IL-1、IL-6和TNF-α。M2巨噬细胞在病原体清除、抗炎反应和代谢以及伤口愈合、组织重塑、免疫调节、肿瘤进展和恶性肿瘤中发挥作用[12] [15]。

M2表型的特点是表达CD206、CD163、CD209、FIZZ1和Ym1/2。一般来说，这种亚型高效表达吞噬作用和清除甘露糖和半乳糖所需的受体，以及能通过精氨酸酶通路增加鸟氨酸和多聚氨基酸的产生[12]。这种类型的巨噬细胞表达的趋化因子有CCL1、CCL17、CCL18、CCL22和CCL24 [11]。

针对巨噬细胞不同的刺激，已知有四种M2亚型：M2a、M2b、M2c和M2d。这些亚型因其细胞表面标志物、分泌的细胞因子和生物功能不同而各不相同。然而，所有M2巨噬细胞亚型都共同表达IL-10[11]。

• M2a巨噬细胞：由IL-4或IL-13活化。IL-4反过来促进甘露糖受体（CD206）的表达。经证实，进一步上调 IL-10、TGF-b、CCL17、CCL18和CCL22能促进细胞生长、组织修复和胞吞作用[11]。
• M2b巨噬细胞：由免疫复合物、Toll样受体（TLR）配体和IL-1b活化。活化后，这种亚型释放促炎和抗炎细胞因子TNF-α、IL-1b、IL-6和IL-10。M2b巨噬细胞在免疫反应和炎症的调节中发挥作用[11]。
• M2c巨噬细胞：由糖皮质激素、IL-10和TGF-b（和灭活的巨噬细胞）活化。这种亚型的特征是高效表达抗炎IL-10、促纤维化因子TGF-b、CCL16、CCL18以及Mer受体酪氨酸激酶（MerTK）[16]，其中MerTK能促进凋亡细胞吞噬。
• M2d巨噬细胞：由TLR拮抗剂、IL-6和腺苷活化。腺苷促进IL-10和血管内皮生长因子（VEGF）的表达，这个过程能加剧血管生成和肿瘤进展[11] [16]。

表 3.人M2巨噬细胞标志物。这些标志物可用于区分M2巨噬细胞和其他类型的细胞。

表 4.小鼠M2巨噬细胞标志物。这些标志物可用于区分M2巨噬细胞和其他类型的细胞。

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作为免疫系统的一部分，巨噬细胞除了在对抗疾病中发挥调节作用之外，在慢性炎症、自身免疫性疾病和癌症中也发挥负向作用。在常规免疫反应中，促炎巨噬细胞受到抑制，致使其促炎信号减弱。在长期损伤过程中，失调的巨噬细胞持续分泌炎性细胞因子并且募集其他免疫细胞。这些过程维持慢性炎症，被认为在肿瘤的发生和发展中发挥重要作用。一旦肿瘤形成，就会使巨噬细胞从免疫活性状态分化为免疫抑制状态。在大多数癌症中，这些所谓的肿瘤相关巨噬细胞（TAM）高度密集，均与患者预后不良有关。在伤口愈合过程中，如果免疫反应控制不够，巨噬细胞也可能导致纤维化。对于其他慢性病包括动脉粥样硬化、哮喘、炎性肠病和类风湿性关节炎[6]，巨噬细胞也起关键作用。

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可以从全血（PBMC分离、巨噬细胞分析、单核细胞分化成巨噬细胞）或组织或肿瘤（组织或肿瘤样本的单细胞悬液制剂）中分离和分析巨噬细胞。此外，人和小鼠单核细胞系有商业化的产品，包括THP-1细胞（急性单核细胞白血病）、U937细胞（组织细胞淋巴瘤）以及RAW264.7细胞（小鼠白血病单核巨噬细胞）和J774A.1细胞（小鼠BALB/c单核巨噬细胞）[17]。

有多种方法可以分离巨噬细胞，包括磁珠细胞分选、密度梯度分离、激光捕获显微解剖和流式细胞仪分选法（FACS） [18]。分离后，可以通过基因表达分析、功能研究、细胞因子和趋化因子生成的评估以及使用免疫荧光染色、免疫检定、流式细胞仪、免疫印迹或聚合酶链反应的蛋白质表达和细胞表面标志物来分析和表征巨噬细胞功能和表型。请注意，并非每种分析方法均需要分离巨噬细胞[18]。

当分析或处理来自组织或肿瘤的巨噬细胞时，通常制备组织或肿瘤切片或单细胞悬液。组织或肿瘤切片可直接用于免疫组织化学（IHC）染色和分析。为了制备单细胞悬液，需要解剖组织或肿瘤，然后进行酶消化。单细胞悬浮液可以直接用于表面标记物的流式细胞术分析等方法

当需要时，可以使用激光捕获显微解剖和流式细胞仪分选法（FACS）或磁珠细胞分选试剂盒分离巨噬细胞。通过流式细胞术(FACS)进行分离时，使用针对细胞表面标记的荧光染料偶联的抗体对细胞亚群进行染色，然后使用细胞分选仪根据定义的分选标准对染色细胞进行分选。使用抗体磁珠细胞分离试剂时，细胞特异性表面标志物的特异性抗体接合在磁珠上，细胞悬液会继续带有磁珠一起孵育。一旦磁珠上抗体与目标细胞的表面标志物结合，再洗去未结合的非目标细胞，就可得到与磁珠结合的目标细胞

此外，可以进一步培养和刺激分离的巨噬细胞。通常，M1巨噬细胞可以通过刺激被重新编程为M2巨噬细胞，反之亦然。巨噬细胞的培养可用于刺激或生成细胞裂解物或细胞培养上清液，其可用于qPCR检测、免疫印迹或各种免疫检测（IA），包括ELISA、基于磁珠的免疫检测（如Invitrogen ProcataPlex多因子试剂盒）和基于PCR的免疫检测（如Invitrogen ProQuantum高灵敏度免疫检测，用于各种细胞因子的定量）。也可以通过检测吞噬作用来研究巨噬细胞功能[17]。

当从全血中分析或处理巨噬细胞时，常用步骤是分离单核细胞并且将其分化为巨噬细胞。因此，使用Ficoll Paque通过密度梯度分离从全血中分离PBMC。这种方法利用了全血中不同细胞类型之间的密度差异。随后，使用FACS流式分选或磁珠细胞分选试剂盒从PBMC悬液中分离CD14+单核细胞，例如，采用InvitrogenInvitrogen Dynabeads Untouched Human Monocytes Kit（类别编号11350D）、InvitrogenInvitrogen DynabeadsCD14（类别编号11149D），或InvitrogenInvitrogen DynabeadsFlowComp人CD14试剂盒（类别编号11367D）。另一种经济高效的分离方法是在组织培养塑料器皿中培养PBMC悬浮液，单核细胞优先粘附在其上;使用明胶涂层表面会增加单核细胞数量。

有多种刺激/分化技术能在体外获得原代巨噬细胞或极化M1或M2巨噬细胞。如果不需要进一步分离单核细胞，则分离的PBMC可通过与含15%胎牛血清（FCS）的Gibco RPMI 1640培养基一起培养直接生成巨噬细胞。

分离的单核细胞可以使用特殊的分化培养基分化成原代巨噬细胞。例如，使用生长因子GM-CSF和M-CSF可以使单核细胞分化成巨噬细胞。可以在RPMI 1640培养基中刺激单核细胞，培养基中添加10% FCS和10ng/mL GM-CSF（Gibco GM-CSF重组人蛋白，货号PHC2013）或10ng/mL M-CSF（Gibco M-CSF重组人蛋白，货号PHC9501）持续7天，能导致M1和M2巨噬细胞分化。刺激后，细胞以细长形状粘附于培养皿表面。

另外，可以用不同的细胞因子先后刺激单核细胞来获得M1和M2极化巨噬细胞。用含10% FCS的RPMI 1640培养基培养得到的细胞，随后用10ng/mL脂多糖处理24小时（Invitrogen eBioscience脂多糖（LPS）溶液， 货号00-4976-03）和50ng/mL IFN-γ（Gibco IFN-γ重组人蛋白，货号 PHC4031）以获得M1巨噬细胞或添加20ng/mL IL-4（Gibco IL4重组人蛋白，货号PHC0041）可获得M2/M2a巨噬细胞。用免疫复合物和IL-1b或LPS处理能促进M2b活化，加入IL-10、TGF-b或糖皮质激素则能促进M2c活化 [14] [19] [20]。可以使用免疫组织化学染色或流式细胞仪分析其表面表达的标志物来识别巨噬细胞类型（表5）。

表5列出了可用于识别巨噬细胞（一般表型）及其表征（功能特征）的标志物。标记物的位置(表面或细胞内)对检测这些抗原的方法有影响。

表 5.近期已知的细胞标记物列表。列出的标志物可用于区分人和小鼠巨噬细胞。

虽然传统的M1/M2模型可以用于体外培养和刺激，来探索不同类型的巨噬细胞活化状态，但对组织巨噬细胞复杂网络的新认识清楚地表明，其无法充分描述这些细胞在体内的功能和表型多样性[21] [22]。 因此，我们建议基于多种标志物的表达和功能特征，采用更灵活和更全面的方法来代替过分简化的M1/M2模型。然而，用于定义M1和M2表型的经典标志物仍然在巨噬细胞表征中发挥重要作用。在这里，我们定义了一些传统的标志物，包括诱导型一氧化氮合酶（iNOS，NOS2）、精氨酸酶-1（Arg1）、甘露糖受体（CD206）、RELM-a（FIX1）和CD163，用于表征巨噬细胞。

iNOS和精氨酸酶1

巨噬细胞（至少在小鼠细胞中）经典激活型和替代活化型的标志物分别为iNOS和Arg1（图4）。iNOS是一种酶，可催化L-精氨酸的NADPH依赖性氧化反应生成L-瓜氨酸和一氧化氮（NO）。一氧化氮是细胞毒性和其他生理功能（例如，血管舒张）的重要介质。iNOS在巨噬细胞中不是组成型表达，其存在能表明此前用促炎细胞因子（如IL-1、TNF-α或IFN-γ）刺激的结果。

Arg1酶将L-精氨酸转化为尿素和L-鸟氨酸。通过降解精氨酸，Arg1占据了iNOS的底物，并且下调一氧化氮生成。IL-4和IL-13强烈诱导巨噬细胞表达Arg1，而不是由抗炎细胞因子（如IL-10或TGF-b）诱导。与iNOS表达相反，在多个组织巨噬细胞群中发现Arg1有表达。例如，大多数小鼠大腹膜巨噬细胞（F4/80 高巨噬细胞）在稳态下呈Arg1阳性。如图4所示，甚至可以在一些受IFN-γ刺激的巨噬细胞中检测到Arg1。因此，Arg1不应被视为M2极化的完全特异性标记，尤其是分析原代未培养细胞时。

甘露糖受体（CD206）

巨噬细胞甘露糖受体，称为CD206或甘露糖受体C类型1（MRC1），介导真菌、细菌、原生动物和病毒抗原的吞噬和内吞摄取，并且在免疫防御及其调节中发挥重要作用。甘露糖受体是替代活化巨噬细胞的原始识别标志物。与Arg1相反，CD206广泛地在替代活化型巨噬细胞中表达，包括用IL-10或糖皮质激素处理的耐受性细胞。有趣的是，TGF-b被证明可以下调CD206的表达。抑制这种受体表达的其他因素包括LPS、IFN-γ和TNF-α。与Arg1相似，CD206组成型表达于多种类型的组织巨噬细胞中，尽管它与Arg1的表达模式不完全重叠。图5中的右组显示了CD206在小（F4/80 lo）和大（F4/80 hi）腹膜巨噬细胞中的组成性表达。

RELM-a（FIZZ1）

RELM-a，也称为抵抗素样α或FIZZ1，是一种由IL-4和IL-13强烈诱导的小细胞因子，参与抵抗寄生虫感染的反应。与Arg1相似，糖皮质激素和IL-10不能诱导RELM-a。尽管如此，这两种常用的M2活化标志物的在体内表达的模式非常不同。例如，在没有刺激的情况下，大多数小腹膜巨噬细胞（F4/80 lo）和少数大腹膜巨噬细胞（F4/80 hi）表达RELM-a（图6）。

CD163

CD163为触珠蛋白和血红蛋白受体。由于CD163的主要功能是促进铁的再循环过程，因此在脾红髓巨噬细胞中可以观察到CD163的最高表达。CD163还可以用于检测某些细菌化合物，并且在组织巨噬细胞的其他亚群中表达，包括Kupffer c细胞、肠固有层巨噬细胞和一部分大腹膜巨噬细胞（图7），尽管表达程度较低。与人CD163不同，小鼠CD163不容易由M2极化细胞因子诱导，故不是鼠科动物M2巨噬细胞的良好标志物。相反，其表达似乎表明了组织特异性巨噬细胞功能（例如，血红蛋白再循环）。

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