细胞成像分析半胱天冬酶活性

半胱天冬酶是半胱氨酸-天冬氨酸特异性蛋白酶家族（CED-3/ICE）成员之一，被认为是凋亡相关的复杂生化事件的关键介质（1）。半胱天冬酶分为两类：启动半胱天冬酶和效应半胱天冬酶，启动半胱天冬酶一旦活化（例如，半胱天冬酶-8和半胱天冬酶-9）、效应半胱天冬酶（例如，半胱天冬酶-3和-7）能裂解蛋白质底物并引发细胞凋亡（2）。半胱天冬酶识别天门冬氨酸残基后的三至四个氨基酸，并将其剪切掉。半胱天冬酶蛋白酶通常合成为无活性的前体，抑制剂释放或辅酶结合通过剪切氨基酸、自催化或其他蛋白酶激活半胱天冬酶。

并非所有的半胱天冬酶都与凋亡有关。近年来，一些半胱天冬酶被证明可能与炎症有关（3）。因为细胞级联死亡是复杂而变化的，所以需要采用多参数方法来准确评估凋亡。

CellEvent 半胱天冬酶-3/7 绿色检测试剂是新一代半胱天冬酶底物，它是研究细胞凋亡的重要工具。CellEvent是一种与核酸结合染料结合且能自由透过细胞膜的四肽 (DEVD)，它可以识别半胱天冬酶 3/7位点。由于 DEVD 肽抑制染料与 DNA 结合的能力，所以 CellEvent 半胱天冬酶-3/7 Green 荧光检测试剂本身无荧光当半胱天冬酶-3/7激活后，DEVD 肽断裂，使染料能够结合到 DNA 上并反应产生明亮的绿色荧光。（吸收/发射波长峰值～502/530nm），表示细胞已发生示凋亡（图1）。这款试剂盒高度检测半胱天冬酶-3/7的活性。因此，当细胞经由半胱天冬酶-3/7抑制剂预处理后，检测不到绿色荧光信号。（图2）

使用CellEvent 半胱天冬酶-3/7 试剂盒的另一重要优点是整个过程不含洗涤步骤，因此避免了洗涤过程中细胞的损失。洗涤过程中凋亡细胞的损失，可能会低估凋亡程度，降低实验准确性。此外，CellEvent 半胱天冬酶-3/7 绿色荧光检测试剂盒不需要甲醛固定，也无需进行细胞破膜，检测后的细胞样品可方便的用于其他实验，也不影响下游免疫组化实验。

观看使用CellEvent 半胱天冬酶-3/7绿色荧光检测试剂盒的视频：

参考半胱天冬酶试剂盒选择指南

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Image-iT LIVE 半胱天冬酶检测试剂盒采用了一种基于荧光胱天蛋白酶抑制剂 (FLICA) 的新颖方法（主要是亲和标记）来检测活性胱天蛋白酶。该试剂将一个可以与半胱氨酸发生共价反应的氟甲基酮 (FMK) 基团和一个半胱天冬酶特异性胺酸序列相连接。对于半胱天冬酶-3/-7，该识别序列为天冬氨酸-谷氨酸-缬氨酸-天冬氨酸（DEVD）；对于多聚半胱天冬酶，该识别序列为缬氨酸-丙氨酸-天冬氨酸（VAD）；对于半胱天冬酶-8，该识别序列为白氨酸-谷氨酸-苏氨酸-天冬氨酸（LETD）。另外再连接上一种荧光染料作为报告分子。FLICA 试剂与已激活半胱天冬酶的反应中心通过识别序列相互作用，之后通过 FMK 基团与半胱氨酸共价连接。FLICA 抑制剂具有细胞渗透性但没有细胞毒性。未结合的 FLICA 分子扩散出细胞并被洗涤掉。剩余的红色荧光信号表是添加抑制剂时胱天蛋白酶的活性（图3）。每个试剂盒均包含一种不可渗透细胞的核酸染料，用于监测质膜完整性。

FLICA试剂广泛应用于流式细胞术和显微镜分析细胞凋亡的研究中（4-8）。然而，应当注意的是，虽然凋亡细胞中的半胱天冬酶活性与细胞的荧光密切相关，但其与细胞的其他位点相互作用可能影响非凋亡细胞的荧光信号强度（9）。任何实验设计均应包括对照组。

参考半胱天冬酶试剂盒选择指南

1. Shalini S, Dorstyn L, Dawar S et al (2015) Cell Death Differ 22: 526-539.
2. Matsuura K, Canfield K, Feng W et al (2016) Int Rev Cell Mol Biol 327: 43-87.
3. Van Opdenbosch N and Lamkanfi M (2019) Immunity 50:1352-1364.
4. Bedner E, Smolewski P, Amstad P et al.(2000) Exp Cell Res 259: 308-313.
5. Amstad PA, Yu G, Johnson GL et al.(2018) BioTechniques 31: 608-616.
6. Dorsey JF, Cunnick JM, Lanehart R et al.(2002) Leukemia 16: 1589-1595.
7. Smolewski P1, Grabarek J, Lee BW et al.(2002) Cytometry 47:143-149.
8. Smolewski P, Grabarek J, Halicka HD et al.(2002) J Immunol Methods 265:111-121.
9. Pozarowski P1, Huang X, Halicka DH, et al.(2003) Cytometry A 55:50-60.