核酸电泳工作流程-5大主要步骤

琼脂糖和聚丙烯酰胺是核酸分离中最常用的两种凝胶基质。两种材料都是三维基质，孔径大小适合核酸分离，且与样品间无反应。 可通过改变基质的百分比来调整孔径大小，从而有效分离不同大小的核酸。

有关琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺之间的选择，主要取决于核酸样品的大小和所希望达到的分辨率，虽然凝胶灌制和样品回收的方法也可考虑( 表1 )。琼脂糖凝胶的孔径大小非常理想，可分离0.1-25 kb范围内的核酸分子。聚丙烯酰胺形成的孔径较小，可用于分离小于1 kb的核酸分子。某些情况下，可采用聚丙烯酰胺凝胶以获得片段小于100bp的单碱基分辨率[1]。

表 1. 琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶之间的差异

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关于凝胶制备，琼脂糖凝胶通常以粉末形式提供，近年来也有方便的预称重片可供使用。为简化工作流程、节省时间，可考虑预制琼脂糖凝胶，其在某些商业化核酸电泳系统中作为集成单元来运行、可视化和分析。

制备您自己的琼脂糖凝胶，凝胶比例计算为:
凝胶%(w/v)=(琼脂糖g/缓冲液ml)x 100%

凝胶灌制时，如果使用了荧光核酸染料，可在凝胶灌制时加入推荐浓度(例如，溴化乙锭0.5 μg/mL)(了解更多: 凝胶可视化)。

表 2 为不同长度的DNA片段分离提供了推荐的琼脂糖凝胶百分比[2]。一般而言，较高比例的凝胶便于更小片段、更好的分离和分辨( 图2 )。注意，低比例凝胶十分脆弱且难以操作，而高比例凝胶则较浑浊，且会干扰可视化。

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聚丙烯酰胺-丙烯酰胺和交联剂—双丙烯酰胺(简称为“bis”)的组分-可以粉末形式提供，但为了方便通常预先制备成原液。该粉末和液体形式是为大家所知的神经毒素，应使用实验室防护性设施，小心操作。在凝胶中，丙烯酰胺和双丙烯酰胺(以%T表示)的总浓度决定了孔隙大小—通常直径为20-150纳米。百分比越高，孔隙越小，可分辨的分子也更小。 表3 展示了常用的凝胶比例[2]。

表 3. 用于分离核酸片段的聚丙烯酰胺凝胶的推荐百分比。变性凝胶用于分离线性单链核酸(尺寸由碱基表示)，而非变性凝胶主要用于双链核酸(bp=碱基对)。

核酸分离，通常采用 3–30%(%T)的聚丙烯酰胺凝胶。除%T之外，双丙烯酰胺(交联剂)与总丙烯酰胺(%C)的重量百分比是聚丙烯酰胺凝胶孔隙大小和样品分离的的关键( 表4 )。

%T和%C可以表示为：
%T(w/v)=[(丙烯酰胺+双丙烯酰胺)g/缓冲液ml]x 100%
%C(w/w)=[双丙烯酰胺g/(丙烯酰胺+双丙烯酰胺)g]x 100%

表 4. 聚丙烯酰胺凝胶的常见组分[5]。

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使用具有导电性的离子溶液制备琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶，确保核酸在电泳过程中具有迁移性。电泳过程中，凝胶和电泳缓冲液通常使用相同类型的缓冲液，以保持相同的pH值和离子强度。核酸电泳常用的两种缓冲液为 Tris-醋酸盐 EDTA (TAE) 和 Tris-硼酸盐EDTA (TBE)，两者都有接近中性的pH值，有利于带负电荷的核酸(了解更多: 凝胶运行中的缓冲液选择）。

为分析单链 DNA或RNA，琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶通常在变性条件下制备和运行。变性条件会破坏核酸之间形成的氢键，从而减少像发夹环这样二级结构的形成。因此，对RNA分离和分析而言，变性电泳更常用。琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶核酸电泳中常用的变性缓冲液包括:

• 琼脂糖：磷酸钠缓冲液中的乙二醛和DMSO、NaOH- EDTA缓冲液、MOPS缓冲液中的甲醛或甲酰胺等
• 聚丙烯酰胺: TBE缓冲液中的尿素

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须计算上样到凝胶中的DNA量，以确保目的条带良好分离，并用于可视化和检测。虽然用荧光染料足以检测1 - 100 ng/条带的DNA，但最小可检测量取决于所用染料(了解更多: 核酸染色特性）[6]。 注意，样品或标准品的超载会造成条带污点并遮盖附近条带，从而导致条带分辨不清，特别是片段大小相似时( 图8A )。

在上样缓冲液中准备好样品和分子量标准，其最终的体积通常占胶孔体积的30%。由于孔底分布不均匀( 图 8B )，使用较少的上样体积会导致条带扭曲。对于含有DNA结合蛋白或粘性末端的样品，凝胶上样之前，混合物需加入至含有SDS的上样染料中一同加热，因为蛋白质结合以及DNA片段之间的相互作用会导致分离效果不佳 ( 图10B )。

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制备凝胶电泳时，样品中添加了凝胶上样缓冲液(通常是6X或10X的原液)。上样缓冲液包括如下组分:

• 密度成分，如甘油或蔗糖，增加样品粘度，确保样品沉入孔中。
• 盐，如Tris-HCl，为样品创造良好的离子强度和pH值环境。高盐浓度的上样缓冲液会产生更大片或扭曲的条带以及污点。
• 金属螯合剂，如EDTA，可阻止样品中的核酸酶降解核酸。
• 染料为监测样品的上样、电泳进展和pH值变化提供了颜色指示。部分上样缓冲液可能包含多个染料，以便有效跟踪样品中不同大小分子的迁移。

通常，上样染料都是带负电荷的小分子，因此迁移方向与核酸相同。其中有的显示pH值颜色，上样和运行时可作为样品的pH指示剂( 图 9A )。常用染料包括溴酚蓝、二甲苯青,苯酚红,和橙色G。选择上样缓冲液时,需注意染料的表面迁移(s)( 图 9B , 表 5 和 6 )以避免遮盖目的核酸条带,特别是分子大小接近时( 图9C )。染料遮盖会影响目的条带的分析和量化，导致结果不可靠。

有时，上样缓冲液包含清洗剂或还原剂，如 SDS, 尿素和甲酰胺，以用于变性。此类添加剂可破坏核酸分子内部和分子间的相互作用，促成线性或单链的分子构象。为获得最佳分离结果，应将样品和变性剂加入至上样染料中一同加热( 图 10A )。对来源于酶反应的双链DNA电泳，可将SDS添加到上样缓冲液，以破坏蛋白质和核酸之间的相互作用，防止样品迁移性改变( 图 10B )。

表 5. 琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶中，溴酚蓝和二甲苯青FF的表观分子大小[2]。

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在凝胶、标准品和样品制备后，进行电泳。拆卸梳子和添加电泳缓冲液前，凝胶须完全凝固。凝胶梳应平稳地向上提起，以免撕裂凝胶、扭曲胶孔。移除梳子和添加缓冲液后，注意清除孔里的气泡。对于聚丙烯酰胺凝胶，应用缓冲液彻底冲洗胶孔，以清除残留未聚合的丙烯酰胺。

水平凝胶应朝向凝胶盒，样品孔位于负极一侧，以便在电泳启动后，将样品移动至正电极侧( 图 11A )。该方向可记为“跑向红色”，因为正电极通常为红色。垂直凝胶盒中，胶孔设计在顶部( 图11B )。

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电泳缓冲液为具有缓冲能力的离子溶液，通常在凝胶中使用，以保证电流流动同时防止pH值变化。电泳过程中，由于电子流动，负极逐渐偏向碱性，正极逐渐偏向酸性，从而导致水电解和pH值改变( 表 6 )。氢气和氧气的释放会引起电极起泡，这是凝胶运行的迹象。理想情况下，电泳缓冲液和凝胶制备缓冲液应相同，以确保有效的导电性。

表 6. 两个电极的化学反应和pH值变化。

电泳缓冲液的选择取决于样品大小、运行时间和后电泳过程，其中Tris-醋酸盐EDTA(TAE)和Tris-硼酸 EDTA(TBE)是最常用的两种缓冲液( 表 7 )[2,7]。

• 因为不容易形成污点，TAE 适用于> 1500 bp的片段。由于缓冲能力较低，TAE更适合短时间的电泳运行(例如< 2小时)。TAE缓冲能力较低，长时间运行凝胶会导致过热，样品变性和/或扩散以及凝胶融化（可能）。
• TBE 缓冲能力较高，不易导致过热，因此更适合长时间运行。对于较短片段的分离，TBE效果更佳，而在TBE中，dsDNA迁移得更慢。TBE可抑制酶，因此不适合涉及酶学步骤的下游应用，如限制性酶切、 克隆、和 PCR。

使用离子强度高于1X TAE或0.5 - 1X TBE缓冲液，可更快地移动样品，但由于高导电性会产生大量的热量，容易导致样品变性和凝胶损伤。

表 7. 缓冲液选择指南。

凝胶应完全浸在缓冲液中，以确保离子流动，防止凝胶干燥( 图 12A )。然而，当使用水平凝胶时（例如，琼脂糖），凝胶上的缓冲液深度应低于3–5 mm。缓冲液过高(> 5 mm)会导致核酸迁移性降低，加大条带扭曲和过热。

注意，变性琼脂糖的电泳缓冲液可能既不是TAE，也不是TBE，因为这些凝胶可能在不同的缓冲液中制备，如磷酸钠和MOPS，(了解更多: 变性凝胶制备)。选择与所用凝胶兼容的电泳缓冲液非常重要( 图 12B )。

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采用恒定电压、电流或功率通过凝胶，施加电势，开始运行凝胶(了解更多: 其对电泳运行的影响）。核酸电泳中常用恒压，一般为5–10 V/cm。

施加的电压(V)=电极间的距离(cm)x建议V/cm

可根据需要分离的DNA片段的大小调整电压，也可以根据所使用的电泳缓冲液的类型进行调整( 表 8 )。 市售核酸分子量标准通常提供建议电压，以便每个产品片段实现最佳分离。注意，电压极低会减缓核酸的迁移，从而导致小分子的扩散和分辨率过低( 图13A )。 另一方面，电压过高，会导致较差的分离效果和样品污点；有时，还会造成缓冲液过热，“微笑型条带”，甚至是样品变性( 图 13B )。

表 8. 基于片段大小的运行条件[2]。

某些情况下，可将温度探头连接至凝胶装置，以帮助控制缓冲液的冷却和加热。电泳运行> 2小时，缓冲液的冷却和再循环可改善样品分离。变性凝胶允许缓冲液加热至55°C，从而改善核酸单链形式，提升实验结果。

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凝胶运行完成后，需对样品进行可视化分析。 由于普通照明环境下，核酸不可见，因此需要一种可视化的检测方法。 如 表 9 所述，可用方法在样品检测中，提供了不同的灵敏度和增益范围[6]。

表 9. 常见核酸凝胶染色和检测方法。

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• 诱变和处置: 溴化乙锭是高度诱变剂，所以荧光染料的危险性较小，无需特殊处理，在核酸电泳中可提供安全工作流程( 图 16 )。
• 灵敏度：灵敏度高于EtBr的荧光染料，适合检测少量样品( 图 16 )。 因为有较少的碱基堆积，单链核酸的可视化通常需要更多样品和/或嵌入染料。因此，优先结合单链核酸 的染料是RNA电泳样品检测的最佳选择。
• 紫外线损害：可用低能量蓝光（而非紫外光）来激发的荧光染料对核酸结构损伤较小，其灵敏度( 图 17A )不仅相同，甚至更高。因此，电泳中使用蓝光激发可提高下游的成功应用，如克隆和测序(图17B)。

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在染料染色处，可通过称作紫外阴影的方法间接观察核酸，利用核酸[8]来吸收紫外线。该方法通常用于通过电泳分离和纯化寡核苷酸和RNA，这种情况下，简单检测已足够，和/或使用嵌入染料会影响下游的应用。为通过紫外阴影进行检测，需要纳克到微克的样品，并使用薄而透明的凝胶（如聚丙烯酰胺）以确保紫外线的吸收和透射。 紫外阴影方法中，电泳后将凝胶从盒中取出（以便最大程度检测），用透明的塑料薄膜包裹后放置在UV -荧光薄层色谱板上。当凝胶至于紫外线辐射下时，核酸条带的吸收会在TLC板上投射阴影( 图18 )。将所需大小凝胶的阴影部分剪去，以作进一步处理。

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可视化后，核酸凝胶通常被存档记录下来，用于记录和分析电泳结果。如果样品被荧光染料染色，需特殊设备以适当的光源激发染料，使其显象并捕捉凝胶图像。激发光源在凝胶上，称为反射照明器(类似于手持式紫外线灯)，或在凝胶下，称为透照器( 图 19 )。由于反射照明器上的光源位置较远，所以样品收到的能量较少。这样可以减少紫外线对核酸的损害，但也会降低凝胶条带的信号。另一方面，透照器可为条带提供更高的信号，但由于辐射接近凝胶，会增加紫外线造成的伤害。

在放射性核酸的电泳过程中，凝胶电泳后会暴露在x射线胶片上，这一过程即称为放射自显影法。条带辐射的强度可用光密度测定来定量。

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综上所述，核酸电泳工作流程采用多种步骤和试剂来分离和分析样品。 为您的样品选择合适工具，并识别工作流程的优缺点，可显著提高分子生物学应用的电泳结果。

1. Stellwagen NC (1998) DNA Gel Electrophoresis. In: Tietz D (editor), Nucleic Acid Electrophoresis (Springer Lab Manual). Heidelberg: Springer. pp 1–53.
2. Green MR, Sambrook J (2012) Analysis of DNA. In: Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4th ed). Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory Press. pp 81–156.
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5. Barril P, Nates Silivia (2012) Introduction to Agarose and Polyacrylamide Gel Electrophoresis Matrices with Respect to their Detection Sensitivities. In: Magdeldin S (editor), Gel Electrophoresis: Principles and Basics. Rijeka: InTech. pp 3-14.
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8. Hassur SM, Whitlock HW Jr (1974) UV shadowing--a new and convenient method for the location of ultraviolet-absorbing species in polyacrylamide gels. Anal Biochem 59(1):162-164.

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