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技术要点和贴士
蛋白质免疫印迹是一种蛋白质研究的常用检测方法。尽管它很普及，但在进行蛋白质免疫印迹时，获得重现性高且可靠的结果并非那么容易。在此，我们为您提供蛋白质免疫印迹的优化指南和技术要点，包括关于蛋白质样品制备、印迹处理和检测的实用技巧。申请获取蛋白质免疫印迹实验要点、技术贴士和常见问题指南。
化学发光蛋白质免疫印迹
凝胶上样不好操作吗？
使用专用的凝胶上样枪头，获得更好的体验。这种枪头通常为特制的超细枪头，可以很容易的进入上样孔底部，而不引起样品的溢出。
想要获得更好的体验？推荐使用 带有楔形上样孔的 Invitrogen 蛋白预制胶。在这类预制胶上，您可继续使用常规的移液器枪头上样多达 60 μL 的样品，无需配备特殊枪头。
高分子量蛋白质转印是否存在问题？
在转印缓冲液中加入 0.01–0.05％ SDS，提高蛋白质从凝胶转移至膜上的效率。
想尝试更好的方法吗？使用我们的 Invitrogen NuPAGE Tris-乙酸蛋白预制胶（推荐用于电泳分离150 kDa 及以上的蛋白质）和 Invitrogen iBlot 2 干转系统，可实现 7 分钟高效转印高分子量蛋白质。
印迹背景有斑点？
尝试过滤牛奶封闭液，获得更好的结果。奶粉通常不能完全溶解，这些不溶解的小颗粒会干扰免疫印迹检测。
想尝试更简单的方法吗？请使用我们的 Thermo Scientific Pierce Clear Milk Blocking Buffer，该缓冲液不含可引起干扰的颗粒物。
没有得到背景干净的印迹信号？
如果使用抗血清而不是纯化的一抗，则可能导致背景较高。可使用不含靶蛋白的裂解物进行纯化。只需向您的抗血清中加入 100 μL 不含靶蛋白的裂解物，摇匀，并在 4°C 下孵育过夜。
其他方法——使用 Thermo Scientific SuperSignal Western Blot 信号增强剂。不仅可以增强信号，还可以减少非特异性结合，获得更好的结果。
是否想通过化学发光法检测多个靶点？
通过将印迹进行剥离后，孵育另一靶点的抗体，在同一印迹上检测 2 个或更多靶标。通过优化实验体系，使用高性能的剥离液，即可在一张印迹上获得更多数据信息。
是否想要更好的体验？切换至荧光模式，使用我们的 Invitrogen Alexa Fluor Plus 二抗进行真正的多重检测。
是否可以多次重复使用您的一抗？
确保抗体中添加了抗菌剂，防止微生物生长。在HRP检测体系中不建议使用叠氮化钠。可使用抗菌剂替代物，例如 KATHON™ 或 ProClin™ 防腐剂，其使用浓度不超过 0.1％。一抗的重复使用次数建议不超过 3 次。
想要更好的方法吗？使用我们的自动化蛋白质免疫印迹处理设备 Invitrogen iBind Western System 获得重复性更好的结果。为了获得最理想的结果，建议每次都使用新鲜配制的一抗。一抗的使用量与常规手工操作的用量相近。
非特异性条带干扰您的蛋白质免疫印迹检测怎么办？
尝试在漂洗和封闭缓冲液中使用不超过 0.05％ 的 Tween 20、Triton X-100 或 NP-40 去垢剂。
尝试其他方法——使用含去垢剂配方的 Thermo Scientific 封闭缓冲液。
想要在您的化学发光印迹中进行PageRuler非预染蛋白分子量标准的检测？
在每10 mL二抗工作液中加入1 µL Strep-Tactin™偶联物，Thermo Scientific™ PageRuler™非预染蛋白分子量标准（货号26614、26630、26632和26637）即可通过曝光或成像系统进行检测。
期待更理想的方法——使用适用于化学发光及荧光检测的Invitrogen™ iBright™预染蛋白分子量标准（货号LC5615）。
采用蛋白质免疫印迹法检测多肽？
在转印缓冲液中加入不超过 20％ 的甲醇，以提高多肽与膜的结合。使用 0.2 μm 的 PVDF 膜以防止多肽穿透膜。
想要更好的方法吗？使用我们的 Invitrogen Novex Tricine 预制胶通过凝胶电泳实现多肽的最佳分离，通过 iBlot 2 干转系统仅需 7 分钟即可高效转印多肽。
不确定您的化学发光底物是否有效？
进行快速暗室测试。在暗室中，向底物工作溶液加入 1 μL HRP 二抗。如果发光，则说明底物有效。如果不发光，则说明需要新的底物。
想要更好的方法吗？使用我们的 Thermo Scientific SuperSignal 系列底物快速获得可靠的高重现性结果。
对印迹膜进行抗体剥离后未获得预期结果？
在加入剥离缓冲液之前，总是使用漂洗缓冲液润湿印迹膜 5-10 分钟。使用自制的剥离缓冲液时，在 37°C 下加热孵育印迹 30 分钟。
想要更好的方法吗？尝试使用我们的 Thermo Scientific Restore PLUS 抗体剥离缓冲液，室温下仅需 10 分钟即可进行有效剥离。
荧光蛋白质免疫印迹
想避免高背景吗？
含溴酚蓝的上样缓冲液会产生荧光，增加背景荧光信号。如果使用含溴酚蓝的上样缓冲液，可延长电泳时间使得染料前沿从凝胶中跑出，或在转印后从膜上裁掉，从而避免其背景荧光信号。
想要更好的方法吗？尝试使用不含溴酚蓝的荧光兼容型上样缓冲液，例如 Invitrogen 荧光兼容型上样缓冲液。
是否想要降低背景荧光，以及信号向相邻泳道的渗透？
降低上样至凝胶中的蛋白分子量标准的用量。使用单色预染的分子量标准，因为多色分子量标准可出现在不同通道中。
想要更好的方法吗？使用专用于蛋白质免疫印迹的蛋白质分子量标准，例如 Invitrogen iBright 预染蛋白质分子量标准，它可提供检测所需的预染蛋白及荧光条带。通常，上样2-4 µL 就足够了。
由于膜选择不当导致背景高怎么办？
膜的属性会影响到背景。选择具有低自发荧光的膜，包括硝酸纤维素膜或特殊的低荧光 PVDF 膜。另外，由于许多墨水会产生荧光，应避免在膜上使用墨水笔，而改用铅笔。
想要更好的方法吗？使用 Invitrogen Nitrocellulose/Filter Paper Sandwich 和 Thermo Scientific 低荧光 PVDF 膜以避免此类问题。
是否存在膜的污染（膜上的斑点和指印）问题？
处理膜时需佩戴手套并使用洁净的钝头镊子。另外，推荐使用高品质经过滤处理的封闭缓冲液，以防止颗粒和污染物沉淀在膜上。
想要更好的方法吗？使用 Thermo Scientific Blocker FL 荧光封闭液，降低交叉反应并提高信噪比。切勿在封闭缓冲液中添加去垢剂，因其可能增加背景荧光。
哺乳动物样品的荧光检测很困难？
使用非哺乳动物来源的封闭液，如鲑鱼血清以确保低背景以及高信噪比。
想要更好的方法吗？使用我们的 Thermo Scientific SEA BLOCK 封闭缓冲液进行荧光检测。SEA BLOCK 封闭缓冲液由硬头鲑血清制成，尤其适合在哺乳动物样品的荧光检测中用作封闭液。
在印迹膜上未观察到信号或信号较弱怎么办？
延长曝光时间以获得更理想的信号。
想要更好的方法吗？通过 Invitrogen iBright FL 成像系统的智能成像功能，轻松获得理想结果。
印迹剥离后没有得到预期结果怎么办？
传统剥离缓冲液可能仅对去除低亲和力抗体有效，重新检测时，无法去除会覆盖靶标信号的染料标记二抗。选择专用于荧光蛋白质免疫印迹的剥离缓冲液。
想要更好的方法吗？尝试我们的 Thermo Scientific Restore 荧光抗体剥离缓冲液，温和的配方专用于快速从蛋白质印迹中去除一抗和近红外（IR）染料标记的二抗。该剥离缓冲液仅适用于低荧光 PVDF 膜。
仅供科研使用，不可用于诊断目的。