Invivofectamine 3.0 试剂常见问题解答

体内实验在本质上非常复杂且不易操作。我们认识到，无论如何明确，该实验方案也不能涵盖所有情况。为帮助确保您的实验获得成功，我们整理了一组常见问题解答以帮助指导您进行工作。我们还建议您利用我们的内部专家来设计您的实验、解答您的问题并在需要时帮助您排查实验的问题。

问：您推荐的 siRNA 纯度水平是多少？
答：我们建议您的 siRNA 尽量具有最高质量。需要使用 Invitrogen 的体内纯度 siRNA 或高纯化和脱盐 siRNA，才能获得良好结果。合成失败、多余的盐、游离核苷酸和不正确纯化的 siRNA 可能导致在体内沉默效率下降。

问：在使用 Invivofectamine 3.0 试剂前，我是否需要浓缩我的 siRNA？
答：在复合前，您的 siRNA 必须在不含 RNase/DNase 水中至少达到 1.2 mg/mL 浓度。siRNA 储备浓度低于 1.2 mg/mL 将导致封装效率低。我们还建议您在复合前使用 Invivofectamine 3.0 试剂确认 siRNA 浓度以验证浓度正确。在不含 RNase/DNase 水中重悬后，测量储备液的几次连续稀释液在 260 nm 处的 OD 值并计算浓度。

问：在体内使用前，我是否需要在体外检测我的 siRNA？
答：是！我们建议您在体外检测至少3种不同的 siRNA 双链（几种不同浓度）并使用在您的体内实验中效力最高的 siRNA 双链。从 体内改为体外 实验时，同样重要的是重新检查双链的种属特异性。

问：我应在实验中使用任何特定的小鼠种系吗？
答：我们建议在体内实验使用近交系，因为这些种系具有均匀的实验背景以确定基因敲低和下游效应。此外，我们建议您从合格供应商处购买身体健康的动物。使用生病或反应迟钝的小鼠开始实验很可能导致实验过程中出现问题。

问：我需要称量小鼠/动物以确定给药或者我可以使用复合材料的200 µL 标准品向全身静脉注射或腹膜注射吗？
答：为了确保结果最佳且毒性最小，确定每个动物的体重非常重要，以便提供正确的剂量并保持多个动物的均匀给药。小鼠的推荐开始剂量为 1 mg/kg (IV)，请根据 siRNA 的效力减少剂量。

问：每次处理时，我应注射多少只小鼠？
答：我们建议每次处理时注射 3-5 只小鼠，以评估实验中结果的可重现性。

问：我应该使用哪些对照品？
答：在进行任何 siRNA 实验时，建议同时使用阳性和阴性对照品。我们通常使用 Ambion 针对凝血因子 VII 的 体内 siRNA（见下表）与 Invivofectamine 3.0 试剂作为实验的阳性对照品（qRT-PCR TaqMan 引物在下表中列出）。使用 PBS 溶液作为阴性对照品也是不错的做法。

问：我能否修改封装协议以满足我的计划？
答：此方案稳健但非常具体。方案修改可能导致性能欠佳。

问：无菌技术有多重要？
答：无菌技术对于成功完成体内实验至关重要。在将复合的 siRNA 注入动物前，所有材料都必须无菌。

问：我应该使用何种速度向全身静脉中注射复合材料？
答：Invivofectamine 3.0 试剂用于缓慢、均匀的给药；应在10至20秒间注射200-µL。

问：我能麻醉我的小鼠进行鼠尾静脉注射吗？
答：我们不建议在注射前麻醉小鼠，因为这可能影响产品的性能。

问：如何从肝脏或其他器官中分离 RNA？
答：分离高质量的 RNA 对于体内实验的总体成功至关重要。

问：对于用于标准化我的 qPCR 分析的基因，您是否有任何建议？
答：我们建议使用管家基因进行标准化。管家基因的表达水平可能有所不同，具体取决于实验条件和/或组织类型。我们已经通过将靶标基因表达标准化为 HMBS 和 GAPDH 获得了较一致的结果。