RT-PCR 是确认通过阵列分析和 siRNA 实验等方法生成的基因表达谱和基因功能分析的最简单的方法之一，尤其是当需要分析的样本较多时。然而，有一个问题。要进行 RT-PCR 实验，必须首先分离总 RNA。为什么不跳过此步骤？Ambion 科学家现已证明使用 Cells-to-cDNA™ II 试剂盒可快速生成实时 RT-PCR 数据且工作量极少。Cells-to-cDNA 细胞裂解物可以直接用于 RT-PCR，无需分离 RNA。在本文中，我们展示了 Cells-to-cDNA™ II 试剂盒如何用于评估 siRNA 实验，以开发优化的 RNA 干扰方案。除分析 siRNA 数据外，Cells-to-cDNA 也可用于处理 FACS 和 LCM 样本。该试剂盒也适用于 96 孔板自动化处理。有关程序，请参见"自动 Cells-to-cDNA 方案"。

实验设置：siRNA 转染

使用 siRNA 转染 HeLa 细胞，然后使用 Cells-to-cDNA II 试剂盒的自动化方案观察 siRNA 效应的特异性和最佳细胞浓度。

检查三种实验条件下的 HeLa 细胞：1) 使用 GAPDH siRNA 转染的细胞、2) 使用阴性对照 siRNA 转染的细胞以及 3) 未转染的细胞。为优化 HeLa 细胞转染的细胞铺板密度，采用了 96 孔板规格。将平板分为 3 部分。各部分对应于上述三种实验条件之一。每行包含相同数量的初始细胞。从平板顶部至底部，依次对细胞进行 2 倍稀释，从 64,000 个细胞开始，以 1000 个细胞结束。这为各实验条件提供了 4 份重复样本。

使用 Silencer™ siRNA 构建试剂盒制备 siRNA。使用 siPORT™ 脂质转染试剂将 GAPDH siRNA 和阴性对照 siRNA（包括在 Silencer siRNA 构建试剂盒中）转染到细胞中，最终浓度为 10 nM。在转染后 4 小时添加新鲜培养基。

数据分析：使用自动化 Cells-to-cDNA II 和一步法实时 RT-PCR

转染后 48 小时，将细胞培养板转移至 Perkin Elmer MultiPROBE II 自动化平台的台面上。执行自动化 Cells-to-cDNA II 方案，然后使用针对 GAPDH 的 TaqMan 探针和引物进行一步法实时 RT-PCR。使用自动化设备去除生长培养基，采用 PBS 洗涤细胞，然后添加 100 µL 的细胞裂解缓冲液。将平板移动到加热瓦中，将样本置于 75°C 下 12 min，同时破坏细胞并使 RNase 失活。用 DNase I 处理样本，然后进行热灭活。将裂解物 (5 µL) 自动转移至含有 20 µL 一步法实时 RT-PCR 预混液的 96 孔 PCR 板中。

该分析确定诱导最大干扰所需的最佳细胞浓度为 2000 个细胞/孔（图 1）。数据清楚地表明，本实验中的最佳 HeLa 细胞铺板数量为 2,000 个细胞（图 1）。在这种铺板密度下，采用靶向 GAPDH 的 siRNA 转染的细胞的 GAPDH 表达水平仅为使用阴性对照 siRNA 转染的细胞相应值的 30%。

有关 Cells-to-cDNA II 自动化方案的更多信息，请参见"使用 Ambion 的 Cells-to-cDNA™ II 试剂盒和 MultiPROBE II HT 液体处理系统的一步法 RT-PCR 自动化"。