第14.4节 膜标记方法中的示踪剂

页面目录

• 长链炭青素：DiI、DiO 及其类似物
• DiA 和 FAST DiA
• 亲脂性示踪剂标样试剂盒
• 十八烷基罗丹明 B
• 质膜染色剂
• Image-iT LIVE 细胞内膜和核标记试剂盒
• FluoroMyelin 荧光髓鞘染色剂
• BrainStain 成像试剂盒
• 数据表
• 订购信息

细胞膜为活细胞和固定细胞加载亲脂性染料提供了便捷的通道。不仅因为细胞可耐受高浓度亲脂性染料，还因为即便是局部应用，染料也可在膜中横向扩散，进而可对整个细胞染色。这些特性使得亲脂性炭青素和氨基苯乙烯染料在神经细胞的前向和逆向追踪中尤为重要。 亲脂性示踪剂可用于标记细胞、细胞器、 脂质体、病毒和 脂蛋白，在细胞移植、迁移、粘附和融合研究等多种长期追踪应用中都有广泛的应用。这些炭青素和氨基苯乙烯示踪剂的显著特征在分子探针亲脂性碳青素和氨基苯乙烯示踪剂的摘要—表 14.3。脂质和膜探针—第 13 章中描述的其他亲脂性探针也被用作脂质的示踪剂。例如，将 BODIPY FL 胆固醇衍生物（C3927MP、鞘氨醇脂质、类固醇、脂多糖和相关探针——第13.3节）掺入脂质体中几乎不可逆，而染料标记的脂质体已与抗体结合，用于免疫靶向应用。

DiI、DiO、DiD 和 DiR

亲脂性炭青素 DiI（DiIC₁₈(3)）、DiO（DiOC₁₈(3)）、DiD（DiIC₁₈₍5)）和 DiR（DiIC₁₈(7)）在水中呈弱荧光，但掺入膜中时则呈强荧光，且具有相当的光稳定性（）。它们在脂质环境中具有极高的消光系数（EC >125,000 cm^-1M^-1，在其最长波长吸收峰处），但量子产额不高，激发态寿命较短（约 1 纳秒）。 一旦应用于细胞，染料会在质膜内横向扩散，导致整个细胞染色。这些探针在完整膜之间的转移通常可以忽略不计，但并非总是如此。 DiI及 其类似物通常表现出极低的细胞毒性；然而，有报道称某些类似物对电子传输链活性有中度抑制作用。

DiI、DiO、DiD 和 DiR 分别表现出独特的橙色、绿色、红色和红外荧光（图 14.4.1），从而有助于多色成像。 DiO（D275）和 DiI（D282、D3911）可分别与标准荧光素和罗丹明滤光片一起使用。在活体动物中，将这些亲脂性染料离子电渗入单个神经肌肉连接处的神经末梢，可以追踪同一运动单元的其他突触末梢。这些亲脂性染料导入活体动物的神经肌肉交界处的某个神经末梢后，可以示踪同一运动单元的另外一个突触终端。 He-Ne 激光可激发 DiD（D307、D7757）的激发和发射光谱比 DiI 更长，为标记细胞和组织提供了有价值的替代方案，这些细胞和组织在相同波长范围内具有与 DiI 荧光相同的固有荧光（）。DiD 在流式细胞仪研究中用作群体标记，该研究还使用 indo-1 来监测细胞内 Ca²⁺ 的动员。 我们的七甲烷基碳青素探针 DiIC₁₈(7)（DiR，D12731）具有更进一步的红色光谱，在近红外区域具有吸收和发射最大值（在甲醇中吸收/发射最大值 =748/780 nm，图14.4.1）。由于这种染料的荧光在人的肉眼不可见，因此必须使用 CCD 相机或其他近红外光敏设备来检测。红外光在细胞和组织中的高传输率以及红外光中低水平的自发荧光使得 DiR 特别适用于活体生物中标记细胞和脂质的体内示踪剂。 脂质示踪剂（包括 DiI 和 DiO 衍生物）对二氨基联苯胺（DAB）的光转换会产生一种不溶的电子致密反应产物 （二氨基联苯胺试剂的光转换荧光探针—注释 14.2）。

Vybrant DiI、DiO 和 DiD 细胞标记溶液

DiI、DiO 和 DiD 具有高度亲脂性，这通常在水培养基中均匀细胞标记时构成障碍。 这种技术上的困难在一定程度上限制了这些示踪剂在细胞融合、 细胞粘附  和迁移  应用中的使用。Invitrogen™ Vybrant™ DiI 细胞标记溶液（V22885）是一种染料输送溶液，可直接添加到常规培养基中，用于均匀标记悬浮或贴壁培养的细胞。配套的 Vybrant DiO 和 DiD 细胞标记溶液（V22886、 V22887）允许在混合后以独特的荧光颜色标记细胞群，以便识别（图 14.4.1）。通过双重标记可以识别融合或形成稳定簇的细胞（图 14.4.2）。每 1mM 的 DiI、DiO 或 DiD 溶液都通过 0.2µm 的聚碳酸酯过滤器过滤。Vybrant 多色细胞标记试剂盒（V22889）中也有这三种细胞标记溶液。Vybrant CM-DiI 标记溶液也有供应（V22888，见下文 CM-DiI）。

NeuroTrace DiI、DiO 和 DiD 组织标记膏

Invitrogen™ NeuroTrace™ DiI 和 NeuroTrace™ DiO 组织标记膏（N22880、 N22881）分别由 DiI 和 DiO 混合制成，并混合到惰性防水凝胶中。三种配方—NeuroTrace DiI、NeuroTrace DiO 和 NeuroTrace DiD—均包含在便捷的 NeuroTrace 多色组织标记试剂盒（N22884）中。此外，还提供 NeuroTrace CM-DiI 组织标记膏（N22883，见下文 CM-DiI）。这些膏状物可直接使用，用针头直接涂在活体或固定的组织样本上。这种应用方法可提高染料在神经元束中的渗透性，标记表面和表面以下的轴突。在类似情况下，直接涂抹染料晶体或注射浓缩溶液只能标记表面的神经元。这种标记方法还能将染料传输率提高 50-80%（匹兹堡大学医学院 H. Richard Koerber，个人通信）。

FAST DiI 和  FAST DiO

从亲脂性炭青素示踪剂的应用点到神经末梢的扩散可能需要几天到几周的时间。 通过在探针的烷基尾部引入不饱和度，扩散过程似乎可以加速。Invitrogen™ FAST™DiI  （D3899， D7756）和 FAST™DiO  （D3898）具有不饱和亚油基（C_18:2）尾部，取代了 DiI 和 DiO 的饱和十八烷基尾部（C_18:0）。据报告，不饱和类似物的迁移速度比 DiI 和 DiO 至少快 50%（田纳西大学 Andrea Elberger，个人通信）。 FAST DiI 和较短链 DiIC₁₂₍3)（D383）在脂质的内吞分拣过程中内化，主要存在于内吞回收室，而 16 碳 Di IC₁₆(3)（D384）被输送到晚期内体。  FAST DiI的全氯酸盐不结晶，是一种粘稠的油（D3899）；然而，f FAST DiI的 4-氯苯磺酸盐（D7756）是固态的，其晶体适合直接应用于细胞。我们还提供 DiI（Δ⁹-DiI, D3886）的单不饱和 顺式-9-十八烯（C_18:1）类似物。

CM-DiI

CellTracker Invitrogen™ CM™-DiI（C7000, C7001）是一种 DiI 衍生物，比 DiIC₁₈(3) 更易溶于水，因此有助于制备细胞悬液和固定细胞的染色溶液。除了在培养基中的溶解度提高外，CellTracker CM-DiI 还含有一种可与硫醇反应的氯甲基部分，使染料能与细胞硫醇共价结合。因此，与其他膜染色剂不同，该标记在固定和渗透步骤中可以很好地保留在某些细胞中  （图 14.4.3, ）。常规石蜡处理后，膜染色仍可使用 CellTracker CM-DiI。 CellTracker CM-DiI 在结合膜标记与后续免疫组织化学分析、荧光 原位 杂交或电子显微镜的实验中特别有用  （）。间充质干细胞的 CM-DiI 标记已被用于追踪其在 体内 移植后的分布和分化。 同样，DNA 阳离子脂质体复合物也被标记为 CM-DiI，以确定它们在小鼠体内注射后的器官和细胞分布。

除了提供 1 mg 克固体 CM-DiI（C7001）或 20 瓶装 CM-DiI（C7000，每瓶 50 µg）外，我们还提供 Vybrant CM-DiI 细胞标记溶液（V22888）和 NeuroTrace CM-DiI 组织标记膏（N22883），分别用于细胞悬浮液和组织的高效标记，这种有用的醛固定示踪剂。

磺化炭青素

由于在水中溶解度较差，通常很难将长链炭青素染料（如 DiI、DiO 和 PKH 染料）加载到悬浮细胞中。为了便于用长链炭青素染料对细胞进行染色，我们开发了磺化青染料 —SP-DiIC₁₈(3)  （D7777）、SP-DiOC₁₈(3)（D7778）、DiIC₁₈(3)-DS  （D7776）和 DiIC₁₈(5)-DS（D12730），它们保留了 DiI、DiD 和 DiO 的 18 个碳亲脂链，但在培养基中的溶解度有所提高。只需将 DMSO 染料储备液稀释至 1-10 µM 的标记浓度，即可在未经改性的培养基中用这些染料标记细胞。我们已经确定，这些磺化染料在杜尔贝科磷酸盐缓冲盐水和汉克斯平衡盐溶液中完全可溶，浓度为 20 µM，至少可保持一小时；在溶液中放置数小时后开始聚集。活细胞对阴离子型炭青素染料的吸收通常比阳离子型炭青素染料慢，产生的染色模式可能完全不同。

一些应用需要在醛类固定和脂质提取后保留膜染色。与 DiI、DiO 或 PKH 染料标记相比， 至少在某些细胞系中，用其中一些磺化炭青素标记细胞似乎与标准的醛类固定方法和丙酮处理兼容。虽然磺化炭青素在细胞中的保留机制尚未确定，但我们观察到，SP-DiIC₁₈(3) 和 SP-DiOC₁₈(3) 在人类 B 细胞中的染色保留效果极佳，而 PKH26 染料（与 DiIC₁₈(3) 结构相同）几乎全部在脂质提取步骤中丢失（图 14.4.3）。CM-DiI（C7000、 C7001、 N22883、 V22888；见上文）在此过程中也能很好地保留。此外，我们还观察到，丙酮处理实际上增强了用 SP-DiIC₁₈(3) 染色的某些细胞的荧光，尤其是用 SP-DiOC₁₈(3) 染色的细胞，这种现象在其他炭青素衍生的膜染色剂中从未出现过。

其他 DiO 和 DiI 类似物

中等亲脂性的炭青素也是标记细胞膜的有用示踪剂。 一些科学家发现，与 C₁₈  同系物相比，亲脂性稍弱的DiIC₁₂(3) (D383)、DiIC₁₆(3) (D384)和DiOC₁₆(3) (D1125)更容易被细胞悬浮液吸收。

用 DiI 和 DiO 类似物进行神经元追踪研究

DiI、DiO 和 DiD 被广泛用于标记活体和固定组织中的神经元突起（图 14.4.4, , ）。染料进入细胞膜的外侧，并横向扩散，从而对精细的神经元突起进行详细标记。据报道，DiI 在活组织中的扩散速度约为每天6 mm，但在固定样本中的扩散速度较慢。 染料通常不会从标记细胞转移到未标记细胞，除非标记细胞的膜被破坏，而且显然不会通过间隙连接转移。

据报道，用DiI 标记的运动神经元在培养中可存活长达四周，在 体内. 可存活一年。据报道，用 DiI 对固定组织中的神经元进行染色可至少持续两年。 DiI 和 DiD 可以同时用于双色追踪  （），以及在激发态能量转移研究中作为荧光供体-受体对。DiO、DiI、DiD 和 DiR 的 组合可用于三色甚至四色测量（图 14.4.1）。

亲脂性炭青素细胞标记通常通过直接涂染染料晶体或染料涂层的纸、金属或玻璃探针，  或通过从DMSO或DMSO/乙醇溶液中微量注射到单个细胞中来完成 。 我们已经描述了一种用DiI和其他脂质示踪剂对细胞进行离子电渗的方法。 我们还提供超大晶体形式的 DiI（D3911），许多研究人员更喜欢将其直接应用于组织。 DiI 标记和共聚焦激光扫描显微镜的详细方案已经发表。DiI 还被用于标记微注射部位，方法是在玻璃微管外部涂上染料。活细胞或固定细胞和组织的  "DiOlistic" 标记使用基因枪来输送涂有亲脂性炭青素染料 DiO、DiI 和 DiD 的微丸，从而实现高密度、高空间分辨率的快速标记。

用膜示踪剂进行长期细胞追踪

亲脂性炭青素示踪剂（如 DiI）也是 体内 和 体外长期细胞追踪的理想标记，包括细胞迁移、移植、 粘附和融合的研究。 DiI 和 DiO 在细胞膜中的存在不会显著影响细胞的存活 、发育或其他基本生理特性。 标记细胞悬液或灌注组织需要染料的水分散体。 大多数示踪剂的储备溶液可在乙醇或二甲亚砜（DMSO）中配制，然后添加到细胞悬液中。几种在培养基中溶解度更高的 DiI 类似物应该有助于这种标记方法（分子探针亲脂性碳青素和氨基苯乙烯示踪剂摘要—表 14.3）。

长链碳青素组织处理和电子显微镜

已经开发出多种方法，可以对含有神经元的组织进行免疫荧光标记，并用DiI染色。 聚酰胺已被用于包埋DiI染色的脑组织，以便进行振动切片 —据报告，这种方法比冷冻切片能更好地保留DiI标记 。 此外，请参阅 分子探针亲脂性碳青素和氨基苯乙烯示踪剂的摘要—表 14.3 ，了解通过固定和渗透程序可能更好地保留的 DiI 和 DiO 类似物的描述。

（回到顶部）

多位研究人员的报告显示，DiA（4-Di-16-ASP，D3883）是一种比 DiO 更好的神经元示踪剂，可用于与 DiI 的多色标记。 DiA 在细胞膜中的扩散速度更快，且比 DiO 更易溶解，因此更有利于细胞标记。例如，DiA 和 DiI 被用于研究背根神经轴突与其靶点以及视网膜轴突生长之间的相互作用。 DiA 在 440 nm 和 500 nm 之间激发，在 DOPC 囊泡中的最大发射波长约为 590nm（红橙色荧光）。然而，其在细胞中的荧光通常是亮绿色至黄绿色（取决于所使用的滤光片组）。多不饱和的FAST DiA 以结晶固体（D7758）形式提供，在膜中的扩散速度可能比 DiA 更快。DiA 的 C₁₀ 类似物 4-Di-10-ASP（D291）已被用作逆行示踪剂，用于监测损伤诱导的大鼠神经元体内降解以及小胶质细胞在清除自然和轴突切断诱导的神经元细胞死亡产生的碎片中的作用（）。4-Di-10-ASP 对微胶质细胞的染色效果至少可以持续 12 个月，可用于 DAB 光转换（二氨基联苯胺试剂的光转换荧光探针—注释 14.2）。已观察到视网膜神经节细胞的轴突突起被 4-Di-10-ASP 染色。

对于希望研究这类膜探针是否适用于特定应用的研究人员，我们准备了亲脂性示踪剂采样器试剂盒（L7781，用于长期细胞标记的 DiI 衍生物）。该试剂盒包含 9 种不同膜染料的1毫克样品，包括相对较新的和成熟的示踪剂：

• DiIC₁₈(3) (DiI)
• DiIC₁₈(3) -DS
• SP-DiIC₁₈(3)
• 5 ， 5'- Ph₂- DiIC₁₈(3)
• DiOC₁₈(3) (DiO)
• SP-DiOC₁₈(3)
• DiIC₁₈(5) (DiD)
• DiIC₁₈(7) (DiR)
• 4-Di-16-ASP (DiA)

十八烷基罗丹明 B（R18，O246）是一种亲脂阳离子，被广泛用于膜探针（膜融合的脂质混合分析——注释 13.1）。用高浓度 R18 标记的病毒颗粒具有高度自熄灭的荧光；因此，病毒颗粒与宿主细胞膜融合会导致与融合相关的荧光增强。

CellMask 质膜染色剂

CellMask 质膜染色剂可快速、均匀地标记细胞表面，且不会像凝集素那样因细胞类型不同而产生差异。 CellMask Orange（C10045）和 CellMask Deep Red（C10046）两种质膜染料分别使用四甲基罗丹明（TRITC）和 Cy5 染料检测配置进行最佳检测。它们对于使用绿色荧光蛋白（GFP）、Alexa Fluor 488 染料、BODIPY FL 染料和其他绿色荧光染料标记的细胞内靶标进行实验时，对细胞表面的标记尤为重要。 膜染色在固定过程中持续存在，但在通透过程中不会发生。因此，对标记有 CellMask 质膜染色剂的细胞中的细胞内目标进行免疫荧光检测时，必须在非渗透条件下进行

基于荧光蛋白的质膜标记剂

CellLight 质膜-CFP、CellLight 质膜-GFP 和 CellLight 质膜-RFP（C10606、C10607、C10608）是 BacMam 表达载体 ，编码青、绿或红自发光蛋白与质膜靶向序列（由 Lck 酪氨酸激酶（Lck10）的 10 个 N 端氨基酸组成）的融合蛋白。这些融合蛋白定位于脂筏，为霍乱毒素 B 结合物（蛋白质结合物——第 14.7 节）和 BODIPY FL C₅-神经节苷脂 G_M1（B13950、B34401；鞘脂、类固醇、脂多糖及相关探针——第 13.3 节）提供了有用的替代方案。 CellLight 试剂（ CellLight 试剂及其靶向序列——表 11.1）结合了 BacMam 技术的所有常规优势，包括高转导效率和持久、可滴定的表达（ BacMam 基因传递和表达技术—注释 11.1）。它们以即用型形式提供——只需添加、培养和成像即可——在细胞系、原代细胞、干细胞和神经元中具有高效的表达。

FM 和 RH 染料

尽管上述亲脂性菁染料和苯乙烯染料可用于染色细胞膜，但它们相对难以应用于细胞，并且最终会内化，染色所有细胞膜。相比之下，FM 1-43（T3163, T35356）、FM 1-43FX（F35355）、FM 4-64（T3166, T13320）、FM 4-64FX（F34653）和 RH 414 (T1111）很容易被细胞吸收，它们与细胞膜快速、可逆地结合，并产生强烈的荧光增强。 这些探针具有较大的斯托克斯位移，可用氩离子激光激发。我们发现这些探针的极性差异对其吸收率和保留特性有较大影响，因此我们推出了 FM 5-95（T23360），这是一种亲脂性稍弱的 FM 4-64 类似物，光谱特性基本相同。

FM 1-43 在标准荧光素滤光片下可有效激发，但在标准四甲基罗丹明滤光片下激发效果不佳。FM 1-43 已被用于勾勒海胆卵中的细胞膜。 这种苯乙烯染料在识别活跃的神经元以及研究不同物种中活性依赖性囊泡循环的机制方面也具有极高的价值（用于追踪受体结合和吞噬作用的探针-第 16.1 节）。我们提供1 mg 小瓶装的F M 1-43（T3163）或 10 瓶每瓶 100µg 的特殊包装（T35356）。

FM 1-43FX 是一种 FM 1-43 类似物，经过修饰后含有脂肪族胺。这种修饰使得探针可以用甲醛类固定剂（包括甲醛和戊二醛）固定。FM 1-43FX 已被用于研究锥体感光细胞末梢中的突触囊泡循环，以及谷氨酸能突触的功能成熟。 FM 1-43FX 有专门包装，每瓶 100 µg，共10 瓶（F35355）。

标记有 FM 4-64 的膜会发出长波长红色荧光，与 FM 1-43 的绿色荧光不同，使用适当的光学滤镜组可以区分这两种荧光，从而实时观察膜回收的两色。 FM 4-64 可选择性地对酵母液泡膜进行染色，是观察液泡细胞器形态和动态以及研究酵母内吞途径的重要工具（溶酶体、过氧化物酶体和酵母液泡探针——第 12.3 节）。此外，FM 4-64 染色已被用于可视化枯草芽孢杆菌孢子形成过程中的膜迁移和融合—这些运动与GFP标记蛋白的易位有关（）。我们提供 1 mg 小瓶装的 FM 4-64（T3166）或 10 瓶装、每瓶 100 µg 的特别包装（T13320）。此外，我们还提供可固定模拟 FM 4-64FX，每瓶100µg，共 10 瓶（F34653）。

当通过允许 510 nm 以上光线通过的远红外滤光片观察时，用 RH 414（T1111）染色的膜会呈现橙色荧光。 在共聚焦激光扫描显微镜研究中，通过测量 DM-BODIPY 二氢吡啶（D7443，离子通道和载体探针——第 16.3 节）的绿色荧光与 RH 414 染色质膜（）的红荧光之间的强度比，确定了嗅球神经元中L型 Ca²⁺ 通道的亚细胞分布。这种方法利用 RH 414 对质膜的染色来控制光学切片中的光学伪影和膜表面积差异。RH 414 还被用于追踪青蛙骨骼肌横纹肌管的液泡化并测量膜电位（膜电位探针—第 22 章）。

Image-iT LIVE 质膜和核标记试剂盒

Image-iT LIVE 质膜和细胞核标记试剂盒（I34406）提供两种染色剂—红色荧光 Alexa Fluor 594 小麦胚芽凝集素（WGA）（激发/发射最大值约为 590/617 nm）和 蓝色荧光 Hoechst 33342 染料（与DNA结合时的激发/发射最大值约为 350/461 nm）—分别用于对活体、绿色荧光蛋白（GFP）转染细胞（）的质膜和细胞核进行高选择性染色。这些染料可以按照提供的方案混合成一种染色溶液，从而节省标记时间和清洗步骤，同时仍能提供最佳的染色效果。细胞不可渗透的 Alexa Fluor 594 WGA 可选择性地与N-乙酰葡糖胺和 N-乙酰神经氨酸（唾液酸）残基结合。 按照操作规程使用，Alexa Fluor 594 WGA 可在血浆膜上形成高度选择性标记，且背景极低，但使用标准荧光显微镜或低倍显微镜观察时，对扁平细胞类型的标记可能不那么明显。在甲醛固定和 Triton X-100 渗透后，Alexa Fluor 594 WGA 仍能保留。这种荧光凝集素结合物也可用于标记固定细胞；然而，为了避免标记细胞内成分，在标记前不应使甲醛固定的细胞通透。值得注意的是，Alexa Fluor 594 WGA 可刺激生物活性，包括糖基化细胞表面蛋白的聚集。该试剂盒还包括 Hoechst 33342 染料，这是一种细胞渗透性核酸染料，对 DNA 具有选择性，与 DAPI 光谱相似。这种染料不会干扰 GFP 荧光，在固定和渗透后仍能保留。Image-iT LIVE 质膜和核标记试剂盒包含：

• Invitrogen™ Alexa Fluor™ 594 小麦胚芽凝集素（WGA）
• Hoechst 33342 核酸染色剂
• 详细的实验方案（Image-iT LIVE 质膜和核标记试剂盒）

每个试剂盒都提供了足够的染色溶液，可用于 360 次实验，按照提供的方案对贴附在盖玻片上的活体培养细胞进行标记。

Vybrant 脂筏标记试剂盒

Vybrant 脂筏标记试剂盒（V34403、V34404、V34405）旨在为活细胞中的脂筏提供方便、可靠且极其明亮的荧光标记。脂筏是不溶于洗涤剂、富含鞘脂和胆固醇的膜微区，在质膜中形成侧向集合体。 脂筏还可以隔离与糖磷脂酰肌醇（GPI）相连的蛋白质和其他信号蛋白和受体，这些蛋白质和受体可能通过其与这些膜微区的选择性相互作用而受到调节。 最新研究表明，脂筏在多种细胞过程中发挥着重要作用，包括细胞信号传导的分区、细胞凋亡的调节、某些膜蛋白和脂质的细胞内运输，以及多种病毒和细菌病原体的感染周期。 研究脂筏的形成和调节是了解真核细胞功能这些方面的关键一步。

Vybrant 脂筏标记试剂盒提供了关键的试剂，用于用我们明亮且极耐光的 Alexa Fluor 染料（）对体内脂筏进行荧光标记。活细胞首先用 Invitrogen™ 染料标记，如绿色荧光 Alexa Fluor™ 488、橙色荧光 Alexa Fluor™ 555 或红色荧光 Alexa Fluor™ 594 霍乱毒素亚基 B（CT-B）结合物。这种 CT-B 结合物与血浆膜神经节苷脂 G_M1 的五糖链结合，后者选择性地进入脂筏。 Molecular Probes 的所有 CT-B 结合物均由重组 CT-B 制备而成，不含有毒的亚基 A，因此无需担心毒性或 ADP-核糖基化活性。然后使用一种特异性识别 CT-B 的抗体将 CT-B 标记的脂筏交联成质膜上的不同斑块，这些斑块很容易通过荧光显微镜观察到。 每个 Vybrant 脂筏标记试剂盒都含有足够的试剂，可用于标记2毫升检测中的 50 个活细胞样本，包括：

• 用 Alexa Fluor 488（试剂盒 V34403）、Alexa Fluor 555（试剂盒 V34404）或Alexa Fluor 594（试剂盒 V34405）染料标记的重组霍乱毒素亚基 B（CT-B）
• 抗霍乱毒素亚基 B 抗体（抗-CT-B）
• 浓缩磷酸盐缓冲液（PBS）
• 详细标记方案（Vybrant 脂筏标记试剂盒）

Vybrant 脂筏标记试剂盒与多种多标记方案兼容，因此也可作为识别与脂筏结合的生理重要膜蛋白的重要工具。在脂筏标记方案中，细胞可以用其他活细胞探针标记，也可以在抗体交联步骤后立即标记，这取决于其他探针的特定标记要求。或者，一旦脂筏被标记和交联，细胞可以被固定以进行长期储存，或者固定并渗透，以便随后用抗体或其他对活细胞不渗透的探针进行标记。

许多研究和生物技术应用需要详细的三维或四维可视化，以观察在天然组织环境中用绿色荧光蛋白（GFP）标记的胚胎细胞。荧光染料标记活胚胎中的所有细胞，为标本中 GFP 表达细胞提供组织学背景。红色荧光标记的 CellTrace BODIPY TR 甲基酯（C34556）可单独使用，也可作为 Image-iT LIVE 细胞内膜和核标记试剂盒（I34407）的一部分使用，是表达 GFP 的细胞和组织的极佳反染剂。 这种染料很容易渗透细胞膜，并选择性地染色线粒体和内质网等内质膜细胞器，但不会出现在质膜上。这些定位特性使染料成为一种理想的重要染色剂，可用于揭示：（1）细胞核的位置和形状，（2）胚胎组织内细胞的形状，（3）整个胚胎内器官形成组织的边界。此外，CellTrace BODIPY TR 甲酯染色在甲醛固定和 Triton X-100 渗透后仍能保留，而且该染料似乎不会对胚胎发育产生任何致畸作用。增强型绿色荧光蛋白（EGFP）和 CellTrace BODIPY TR 甲酯的发射光谱可以很好地分离，峰值分别在 508 nm 和 625 nm（图 14.4.5），从而可以同时进行双通道共聚焦成像，而不会使GFP荧光大量溢出到CellTrace BODIPY TR甲酯检测通道中。

Invitrogen™ Image-iT™ LIVE 细胞内膜和细胞核标记试剂盒提供：

• CellTrace BODIPY TR 甲酯，用于细胞内膜染色
• Hoechst 33342 染料，用于细胞核染色
• 详细的实验方案（Image-iT LIVE 细胞内膜和细胞核标记试剂盒） 

这两种荧光染料特别适合与活体 GFP 表达细胞（）兼容，可以混合成一种染色溶液，以节省标记时间和清洗步骤，同时仍能提供最佳的染色效果。每个试剂盒都提供了足够的染色溶液，可用于 250 次实验，按照提供的方案对贴附在盖玻片上的活体培养细胞进行标记。

荧光髓磷脂绿和荧光髓磷脂红荧光髓磷脂染色剂（F34651、F34652）能够快速、选择性地对大脑冷冻切片中的髓磷脂进行标记。髓磷脂可视化有助于了解髓磷脂的分布，识别大脑结构和其他标记的相对位置，以及绘制大脑内特定区域的图谱。传统方法需要使用抗体，如抗髓磷脂碱性蛋白，或显色（透射光）方法，如Loyez法或Schmued的氯化金技术，所有这些方法都很耗时，需要一至三天的时间完成多个步骤。相比之下，FluoroMyelin 染色仅需 20 分钟的标记步骤和清洗。标准的 FITC 滤光片组适用于 FluoroMyelin Green 染色的成像，几乎不会渗入标准的 DAPI、TRITC 或远红滤光片组。标准 TRITC 或 Texas Red 滤光片组适用于 FluoroMyelin Red 染色成像，几乎不会渗入标准 DAPI、FITC 或远红滤光片组。这些染色剂可与抗体和其他染料结合使用，也可与脑冷冻切片的标准组织化学方法结合使用；它们是研究多发性硬化症等脱髓鞘疾病的理想选择。 除了单独使用外，FluoroMyelin 染色剂还可以与其他染料结合使用，只需一个标记步骤即可，如下文所述，我们的 BrainStain 成像试剂盒中就包含 NeuroTrace 530/615 红色荧光尼氏染色剂和 DAPI 核酸染色剂，可实现三色可视化。

BrainStain 成像试剂盒（B34650）可在 20 分钟的染色步骤和清洗（, ）中实现脑切片中的髓磷脂、神经元和细胞核的三色组合标记。该试剂盒包含新型染色剂，可单独使用或混合使用，取代耗时一到三天的传统方法。免疫组织化学等标准组织化学方法与这些染色剂兼容。每套 BrainStain 试剂盒包括：

• FluoroMyelin 绿色荧光髓鞘染色剂
• NeuroTrace 530/615 红色荧光尼氏染色剂
• DAPI 核染色剂
• 小鼠脑冷冻切片染色详细方案（BrainStain 成像试剂盒）