Click 化学与高特异性 BrdU 抗体相结合

测量细胞增殖是评估细胞健康、遗传毒性和药物疗效的基础。传统的细胞增殖评估方法是使用核苷类似物的单个“脉冲”来温浴细胞，核苷类似物被整合到 DNA 中，通过放射性、抗体或点击化学来检测。一些应用，如药效测试，受益于在不同的时间点合并两个不同的类似物（双脉冲标记），这可以进一步定义细胞周期动力学。随着新的高特异性 anti-BrdU 抗体的出现，BrdU 标记技术可以与点击化学检测技术相结合，从而简化双脉冲标记方法。

EdU 和 BrdU 的优势相结合

传统的细胞增殖检测方法是在 DNA 合成过程中加入胸苷类似物 BrdU（5-溴-2´-脱氧尿苷），然后用 anti-BrdU 抗体检测[1-4]。该方法正迅速被基于点击化学的Click-iT EdU 测定法所取代[5,6]，与使用溴脱氧尿苷（BrdU）检测法不同，Click-iT EdU 检测法不依赖抗体，因此并不需要 DNA 变性以检测掺入的核苷。Click-iT 检测法使用修饰的核苷 EdU（5-乙炔-2´-脱氧尿苷），它在 DNA 合成过程中被结合，并使用 click 反应—一种在叠氮化物和炔之间的铜催化反应进行检测。

Click-iT EdU 是如何工作的

 Click-iT EdU—点击化学的简单性使之成为比3H-胸苷和 BrdU 更快、更友好的替代品。与使用溴脱氧尿苷（BrdU）检测法不同，Click-iT EdU 检测法不依赖抗体，因此并不需要 DNA 变性以检测掺入的核苷。相反，Click-iT EdU 利用点击化学检测各种 Alexa Fluor 荧光染料的荧光。更重要的是，顺畅的检测实验方案不仅减少了总的步骤，还显著地缩短了总的操作时间。

高度特异性的检测 EdU 和 BrdU

传统的细胞增殖双脉冲标记方法是利用与碘脱氧尿苷（IdU）或氯脱氧尿苷（CldU）发生交叉反应的不同克隆的多个 BrdU 抗体，通过与 IdU 和 CldU 交叉反应的 BrdU 免疫细胞化学方法来检测[7]。这种复杂的方法可以通过使用胸苷类似物 EdU 和 BrdU 的连续脉冲大大简化，但一个主要的挑战是，许多 anti-BrdU 抗体都表现出与 EdU 的交叉反应性。

新 anti-BrdU 抗体克隆 MoBU-1 与用于 Click-it EDU 检测的 EDU 没有交叉反应（图 1）。这种双脉冲检测方法对每种修饰核苷都具有很高的特异性，在加入 BrdU 之前不需要更换或去除 EdU（图 2）。

Anti-BrDU 与 EdU 不发生反应

图 1.Anti-BrdU 抗体克隆 MoBU-1 与 EdU 不发生反应用 10 μM EdU 处理 Jurkat T 细胞 1 小时后用乙醇固定，酸变性后，再标记常用的 anti-BrdU 克隆的 FITC 缀合物，这些克隆包括3D4、PRB-1 和 MoBU-1。采用 BD™ LSR II 型流式细胞仪，488 nm 激发激光对细胞进行分析，用 530/30 带通滤光片收集荧光。在所测克隆中，只有克隆 MoBU-1 与 EdU 无反应。

用 BrdU 和 Click-iT EdU 双脉冲标记细胞增殖 图 2.用 BrdU 和 Click-it EdU 双脉冲标记细胞增殖。TF-1 红细胞用 20 μM EDU 脉冲 1 小时，然后用 10 μM BrdU 脉冲 1 小时。将细胞固定于乙醇中，酸变性后，用anti-BrdU（克隆MoBU-1）-Alexa Fluor 488 偶联物和Click-iT EdU-Alexa Fluor 647 叠氮进行标记。用 BD™ LSR II 流式细胞仪采集数据，488 nm 激发采用 530/30 带通滤波器，633 nm 激发采用 660/20 带通滤波器。蓝色的细胞对 EdU 和 BrdU 均为阴性；深绿色细胞对 EdU 和 BrdU 均呈阳性；红色细胞对 EdU 呈阳性，对 BrdU 呈阴性；浅绿色的细胞对 EdU 呈阴性，而对 BrdU 呈阳性。

适用于多种应用程序的简单分析方法

MoBU-1 anti-BrdU 抗体克隆对 BrdU 具有较高的特异性，且与 EdU 无交叉反应。该克隆还可以通过 TUNEL 法检测 RNA 中含有的溴吖啶（BrU）或 DNA 链断裂中含有的 BrdUTP。MoBU-1 的共轭物可以通过流式细胞术、荧光显微镜和高含量成像技术直接测定（图 3）。该克隆的未共轭形式和生物素共轭物分别需要二级抗体和链霉亲和素共轭物进行检测。

双脉冲标记细胞增殖的高含量成像与分析。

图 3.双脉冲标记细胞增殖的高含量成像与分析。采用双脉冲标记法评价不同药物对 DNA 复制的影响。用 10 μM EdU 脉冲 U2OS 细胞 60 分钟，洗净后用氯喹、罗格列酮、对乙酰氨基酚或依托泊苷处理，或不做任何处理放置 23 小时。用 10 μM BrdU 脉冲细胞 60 分钟，固定及变性后，再进行 Click-iT EdU Alexa Fluor 488 成像试验来检测 EdU（绿色）。使用anti-BrdU（克隆 MoBU-1）-Alexa Fluor 594共轭物（红色）检测 BrdU 的掺入。用HCS NuclearMask™ Blue stain对细胞核染色。（左）对照细胞双标记 EdU 和 BrdU，用 Zeiss Axiovert 200M 显微镜成像。（右）几种药物抑制了 DNA 复制，表现为 BrdU 阳性细胞少于 EdU 阳性细胞。使用 Arrayscan VTI 平台（Thermo Scientific Cellomics）采集数据。

参考文献

  1. Gratzner HG (1982) Science 218:474–475.
  2. Dolbeare F, Selden JR (1994) Methods Cell Biol 41:297–316.
  3. Li X, Darzynkiewicz Z (1995) Cell Prolif 28:571–579.
  4. Conboy MJ, Karasov AO, Rando TA (2007) PLoS Biol 5:1120–1126.
  5. Salic A, Mitchison TJ (2008) Proc Natl Acad Sci U S A 105:2415–2420.
  6. Buck SB, Bradford J, Gee KR et al.(2008) Biotechniques 44:927–929.
  7. Current Protocols in Cytometry Vol. 1, JP Robinson, Ed., John Wiley & Sons Inc. (2007).
仅供研究使用。不得用于任何动物或人类的治疗或诊断。