抗体纯化方法

生产和使用特异性抗体作为检测探针和纯化配体（通常称为免疫检测或免疫技术），给生物研究和诊断技术带来了革命性的变化。使用制备好的抗原对动物进行免疫，会产生针对这种抗原的特异性抗体。一旦这些抗体被纯化（并可能用酶或荧光标签标记），就可直接用于蛋白免疫印迹、酶联免疫吸附试验 (ELISA) 和其他应用中检测特异性抗原。

免疫动物的抗血清可直接用于某些应用，但更常见的是需要某种形式的抗体纯化，以获得对多种检测方法有效的抗体探针。本文总结了抗体纯化的主要方法和工具。

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• 抗体纯化介绍
• 理化分馏抗体纯化
• 类别特异性抗体亲和纯化
• 抗原特异性抗体亲和纯化

抗体纯化涉及从血清（多克隆抗体）、腹水或杂交瘤细胞系的细胞培养上清（单克隆抗体）中选择性富集或特异性分离抗体。抗体纯化方法从非常粗糙到高度特异，可分为以下几种：

• 物理化学分离 - 基于免疫球蛋白在典型样品中的大小、电荷或其他共同化学特性，通过差异沉淀、分子排阻或固相结合方法对免疫球蛋白进行分离。该方法可以分离出包括免疫球蛋白在内的一类样品蛋白。
• 类别特异性亲和 - 通过对免疫球蛋白具有特异亲和力的固定化生物配体（蛋白、凝集素等），固相结合特定种类的抗体（如 IgG） 。该方法可以纯化目标类别的所有抗体，而无需考虑抗原特异性。
• 抗原特异性亲和 - 只对样品中通过特异性抗原结合结构域与特定抗原分子结合的抗体进行亲和纯化。这种方法可以纯化所有与该抗原结合的抗体，而不考虑抗体的类别或亚型。

使用单克隆抗体杂交瘤细胞系开发并以腹水或细胞培养上清液形式生产的抗体，可以不使用抗原特异性亲和方法（第三种）进行完全纯化，因为目标抗体（对于大多数实际用途而言）是产物样品中唯一的免疫球蛋白。相比之下，对于多克隆抗体（血清样品），则需进行抗原特异性亲和纯化，以避免非特异性免疫球蛋白的共纯化。例如，在小鼠血清中，一般只有 2% - 5% 的总 IgG 对用于免疫动物的抗原具有特异性。获得可用抗体所需的纯化类型和纯化程度取决于该抗体的预期应用。

了解更多信息：亲和纯化概述

血清免疫球蛋白的主要类别（例如，IgG、IgM）具有相同的 基本结构，包括总体氨基酸组成和溶解特性。这些一般特性与血清中的大多数其他丰富蛋白质（如白蛋白和转铁蛋白）有很大不同，因此可以根据这些不同的理化特性选择和富集免疫球蛋白。

了解更多信息：免疫球蛋白介绍

透析、脱盐和重滤 可用于将抗体交换至特定缓冲液中，并去除不需要的低分子量 (MW) 成分。可以使用具有高分子量截留值 (MWCO) 的透析膜、分子排阻树脂和透析过滤装置，从小规模蛋白分子和肽中分离免疫球蛋白 (>140 kDa)。但是，除非使用专用的色谱柱和设备，否则，单靠这些技术无法从典型抗体样品存在的其他蛋白质和大分子中纯化抗体。更常见的方法是在硫酸铵沉淀等其他纯化步骤之后使用凝胶过滤和透析 [1]。 

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硫酸铵沉淀法经常用于从血清、腹水或细胞培养上清中富集和浓缩抗体。随着样品中这种溶解盐的浓度逐渐上升，蛋白和其它大分子的溶解度逐渐降低，直到它们沉淀出来；这种溶解效应被称为 "盐析"。与大多数其他蛋白质和血清成分相比，抗体在硫酸铵浓度较低时就会沉淀。

在硫酸铵饱和度为40% 至 50%（100% 饱和度等于 4.32 M）时，免疫球蛋白会沉淀，而其他蛋白仍保留在溶液中 [2]。常用的方法是将等体积的饱和硫酸铵溶液缓慢加入到中和后的抗体样品中，然后在室温或 4°C 下孵育几小时。离心并去除上清液后，将抗体沉淀物溶解于缓冲液中，如磷酸盐缓冲盐水 (PBS)。

沉淀的选择性、产量、纯度和可重复性取决于多种因素，包括时间、温度、pH 和加盐速率 [3]。硫酸铵沉淀可为某些抗体应用提供充分的纯化效果，但大多数情况下，硫酸铵沉淀是柱层析或其他纯化方法（例如， Melon 凝胶单克隆 IgG 纯化试剂盒）之前的一个初步纯化步骤。使用部分纯化的抗体样品可以提高亲和柱的性能并延长使用寿命。

其他用于特殊抗体纯化情况的抗体沉淀试剂包括辛酸、聚乙二醇和依沙丫啶 [3]。 

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许多基于化学反应的固相色谱方法已经过调整和优化，以实现特定情况下的抗体纯化。

离子交换色谱法 (IEC) 基于蛋白在特定缓冲液系统 (pH) 中的净电荷，使用带正电荷或负电荷的树脂与蛋白结合。特别是在涉及单克隆抗体生产的商业化操作中，可以确定 IEC 高特异性地结合和释放靶抗体的条件。反之，也可以找到某个条件，使树脂可以结合样品中除了抗体以外的几乎所有其它组分。一旦经过这样的优化，IEC 可成为一种节约成本、条件温和且可靠的抗体纯化方法。

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固定化金属螯合色谱 (IMAC) 使用螯合固定的二价金属离子（通常是镍离子，Ni ²⁺ ）结合含有三个或更多连续组氨酸残基的蛋白或肽。该策略最常用于纯化含有末端 6xHis 融合标签的重组蛋白。有趣的是，哺乳动物 IgG 是血清（或单克隆杂交瘤细胞培养上清）中少数几种具有能够与固定化镍结合的组氨酸簇的丰富蛋白之一。与 IEC 一样，IMAC 的结合和洗脱条件可以根据特定样品进行优化，以提供温和可靠的抗体纯化 (3)。例如， Pierce 偶联物纯化试剂盒就是利用这种抗体纯化技术，在标记操作步骤之后，将 AP 或 HRP 标记的（酶偶联）抗体与多余的、未偶联的酶分离。 

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亲硫吸附是一种高选择性的蛋白-配体相互作用，结合了疏水作用色谱 (HIC) 和硫酸铵沉淀 (溶解效应) 的特性。这种相互作用被称为亲硫作用，因为涉及蛋白与邻近硫醚的磺基结合。与严格的 HIC 相比，亲硫吸附依赖于高浓度的溶盐（例如，硫酸钾而非氯化钠）。对于用硫酸钾平衡过的典型抗体样品，抗体的结合具有很强的特异性。未结合成分被洗去后，在温和的洗脱条件下（例如 50 mM 磷酸钠缓冲液，pH 7-8），抗体很容易被回收。亲硫吸附剂（也称为 T-凝胶）是一种经修饰后含有磺基-硫醚配体的 6% 珠状琼脂糖。这种吸附剂对各种动物的免疫球蛋白具有很高的结合能力和广泛的特异性。值得注意的是，它是少数几种可以有效纯化鸡 IgY 的亲和方法之一。

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Melon 凝胶是一种专有的化学树脂（和优化的缓冲液系统），用于通过化学分馏纯化抗体。在特定的温和缓冲液条件下，Melon 凝胶树脂能与血清、腹水和培养物上清中的大多数非 IgG 蛋白结合，同时还能在流出的组分中收集纯化的 IgG。

多种 Melon 凝胶试剂盒 经过优化，可快速、方便且温和地纯化 IgG。Melon 单克隆抗体纯化凝胶试剂盒说明了两种纯化技术相结合的好处。在进行最终的 Melon 凝胶纯化之前，建议对细胞培养物上清样品进行硫酸铵沉淀。建议在进行 Melon 凝胶纯化之前，使用调节试剂处理腹水样品，以减少转铁蛋白与抗体的共纯化。

由于 Melon 凝胶系统使用阴性选择并且不需要洗脱步骤，因此它还提供了一种便捷有效的方法，可以去除抗体储备液中牛血清白蛋白 (BSA) 或明胶，从而使这些稳定蛋白不会干扰抗体标记过程。这是 抗体清理试剂盒的基础。

如果说特异性地去除血清中某种特别不需要的组分也视为抗体纯化的一种形式，那么在此提及去除白蛋白则是恰当的。白蛋白约占人类血清蛋白的 60%。Cibacron* Blue Dye 可选择性地结合人类血清白蛋白，因而它可被用作亲和配体，制备不含白蛋白的血清样品，用于2D 电泳分析。

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由于抗体具有进化上保守的整体结构，包括相对不变的结构域，并且其天然功能涉及对病原体的结合和防御，因此，某些致病菌进化出具有特异性抗体结合功能的蛋白就不足为奇了。目前已经从某些细菌种属中鉴定和分离出几种这样的免疫球蛋白结合蛋白。就像抗体的天然功能可用作标靶特异性探针用于蛋白研究，这些天然的抗-Ig 蛋白也可用作抗体纯化的亲和配体。 

了解更多信息：亲和纯化概述

蛋白 A、蛋白 G 和蛋白 L 是三种细菌蛋白，它们的抗体结合特性已得到很好的表征。这些蛋白已通过重组技术生产，并被常规用于亲和纯化来自不同种属的关键抗体。大多数市售的这些重组形式的蛋白已经删除不必要的序列（包括蛋白 G 的 HSA 结合结构域），因此其大小小于原生蛋白。基因工程重组形式的蛋白 A 和蛋白 G（称为蛋白 A/G）同样可广泛购买。研究人员已将所有四种重组 Ig-结合蛋白广泛用于进行多种免疫检测和免疫亲和实验中。

抗体结合蛋白的结合位点。用于将抗体固定化到珠化载体上的蛋白对抗体的不同结构域具有特异性。蛋白 A 和 G 结合到抗体 Fc 区域的重链，而蛋白 L 特异性地结合抗体 F(ab')2 片段两个 Fab 区域的轻链。† 在某些条件下，蛋白 G 也可以结合 Fab 片段。

了解更多信息：IgG 结合蛋白（蛋白 A 、G、A/G 和 L）的比较
了解更多信息： Tech Tip #34：IgG 结合蛋白的结合特性

要利用 蛋白 A、蛋白 G、蛋白 A/G 或 蛋白 L 完成抗体纯化，需要将它们共价固定到多孔树脂（例如珠状琼脂糖）或磁珠上。由于这些蛋白含有多个抗体结合结构域，因此几乎每个被固定的分子，无论其方向如何，都能保有至少一个功能完整且不受位阻影响的结合结构域。而且，由于这些蛋白结合抗体的位点不同于抗原结合结构域，因此，这些蛋白的固定化形式可用于其它纯化方案，例如免疫沉淀，在该方法中，抗体结合蛋白通过结合抗体（此时抗体已与抗原结合），从样品中纯化出抗原。

蛋白 A、G、A/G 和 L 具有不同的结合特性，使得每一种蛋白适用于不同类别的抗体靶标（例如，抗体亚类或动物种属）。重要的是，需认识到，使用蛋白 A、G 和 L 可以从粗样品中纯化出总免疫球蛋白。根据样品来源的不同，抗原特异性抗体仅占样品中总免疫球蛋白的一小部分。例如，在小鼠血清中，一般只有2-5%的总IgG对用于免疫动物的抗原具有特异性。

以蛋白 A 琼脂糖树脂柱和兔血清为例，使用这些配体进行抗体纯化的基本流程和总体步骤如下：

1. 结合： 将经过澄清、生理缓冲 (pH 7-8) 的兔血清样品加入到柱中，使其缓慢通过或与蛋白 A 树脂混合，使得 IgG 与固定化的配体结合。
2. 洗涤 ：加入磷酸盐缓冲液 (PBS)，使其缓慢通过色谱柱，以洗去未结合的血清组分。使用等同于 5-10 个树脂体积的洗涤缓冲液。 
3. 洗脱： 加入酸性洗脱液（例如，0.1 M 甘氨酸-HCl，pH 2.8），收集从柱中流出的小部分溶液。低 pH 条件能够使抗体与固定化的蛋白 A 分离，再从一个或多个收集的组分中回收纯化的 IgG。
4. 中和或交换缓冲液： 使用蛋白检测法或其它方法鉴定和合并含有纯化抗体的洗脱组分。然后加入十分之一体积的 1 M Tris-HCl (pH 8.5) 中和缓冲液。或者，使用一个脱盐柱或透析方法，将纯化的抗体交换至更稳定的缓冲液，以长期保存。

了解更多信息：亲和纯化概述

蛋白 A 和蛋白 G 结合 IgM 的能力非常差或根本不结合，部分原因是 IgM 的五聚体结构阻碍了其 Fc 区域上的结合位点。对于拥有适当类型轻链 (Vl-κ) 的 IgM（M 类抗体），可使用蛋白 L 进行纯化；但是，拥有相同类型轻链的 IgG 也会共纯化出来。

在商业化操作中，IgM 抗体纯化的原理和步骤通常使用多种技术，包括硫酸铵沉淀以及之后的凝胶过滤、离子交换层析或区带电泳。对于血清样品（多克隆），一种简单的富集策略是先使用硫酸铵沉淀，然后使用蛋白 A 或蛋白 G 去除 IgG。 

Nethery 等人[4] 开发出一种利用 C1q 的 IgM 亲和纯化方法，C1q 是一个 439 kDa 的补体成分，可以识别细胞表面的糖类。Nevens 等人[5] 通过使用结构相似的补体激活蛋白——甘露糖结合蛋白 (MBP)，扩展并改进了这一方法。我们的 IgM 纯化试剂盒 使用固定化的 MBP，对于从大鼠腹水中纯化 IgM 最有效。将样品一次性通过亲和柱便可得到纯化的 IgM。人IgM 可以结合至该支持物，尽管结合能力较低，但经 HPLC 评估，其纯度至少为 88%。其他物种和小鼠血清中纯化 IgM 的方法尚未得到优化。

了解更多信息：免疫球蛋白 IgM 类

木菠萝素是一种 a-D-半乳糖凝集素，提取自木菠萝种子 (Artocarpus integrifolia) 。凝集素是一种糖蛋白，分子量约为 40 kDa，包含四个相同的亚基。固定到载体（如琼脂糖）上的木菠萝素可用于纯化人血清或分泌型 IgA1。这种亲和配体可以从人血清或初乳中含量更高的IgG 和 IgM中纯化或去除IgA [6]。有报告称，IgD 可以与木菠萝素结合 [7]。 

了解更多信息：免疫球蛋白 IgA 类别

立即查看： Jacin 琼脂糖

鸡能够产生一种独特的免疫球蛋白分子，称为 IgY。与哺乳动物的免疫球蛋白相比，IgY 的生产和使用具有多个优势。在生产方面，鸡的饲养和免疫相对容易，鸡对保守的哺乳动物蛋白抗原产生免疫反应的可能性更大，而且鸡产生的抗体量是兔子的 15-20 倍。

更重要的是，IgY 天然存在于鸡蛋黄中，浓度很高，因此能够非侵害地从免疫母鸡鸡蛋反复收集抗体。一个来自免疫母鸡鸡蛋的蛋黄中含有约 300 mg IgY。可以收集整个鸡蛋或分离的蛋黄并冷冻保存，以备之后用于提取抗体。

蛋白 A、蛋白 G 和其它 Fc 结合蛋白不与 IgY 结合。亲硫吸附剂（如上所述）可以从血清和其它液体中有效地纯化 IgY。但是，对于鸡蛋蛋黄，尚未开发出有效的亲硫吸附方法，因为蛋黄含有很高浓度的脂类。因此，我们的鸡 IgY 纯化试剂盒提供了从鸡蛋蛋黄纯化 IgY 的有效方法，首先使用一种专利溶液对鸡蛋蛋黄进行脱脂处理，然后使用硫酸铵沉淀法对抗体进行纯化。

立即查看：鸡 IgY 纯化试剂盒

尽管蛋白 A、G、A/G 和 L 是纯化样本中总 IgG 的优秀配体，但通常还需要纯化抗原特异性抗体。这可以通过固定用于免疫的特定抗原来实现，这样在纯化过程中只能纯化与抗原特异性结合的抗体。另一篇名为《用于亲和纯化的配体固定化方法》（链接即将发布）的文章介绍了可用于在亲和纯化中固定肽或其它抗原的活性亲和支持物。本文总结了抗体纯化中使用的抗原固定化的一些问题。

成功的抗体亲和纯化取决于抗原上相关表位的有效呈递以使表位能够与抗体的结合位点有效结合。如果抗原很小而且是通过多个化学键直接固定到固相支持物表面，重要的抗原表位可能会被覆盖或受到位阻，从而阻碍抗体的有效结合。因此，最好使用一个独特的功能基团（例如，肽末端单个半胱氨酸的巯基）来固定肽抗原，并使用一种活性支持物，其活性基团位于多个原子长度的连接臂上。对于较大的（例如，蛋白）抗原，尤其是那些具有多个免疫反应位点的抗原，连接臂的长度变得不再那么重要，因为抗原本身充当了支撑支持物基质和表位之间的有效连接臂。一般来说，如果抗原与载体蛋白交联以促进抗体的生产，那么在进行亲和纯化时，使用相同的化学反应（例如与伯胺、巯基、羧基或醛类反应）固定化抗原能获得最佳结果。这样的话，所有表位都能暴露出来供抗体结合，从而提高特异性免疫球蛋白纯化和回收的效率。

立即查看：蛋白固定化

大多数抗体都是利用合成的多肽抗原与免疫原性载体蛋白（如KLH）结合产生的。此类抗原可定制为含有独特的功能基团（柄），用于连接和固定。为了这个目的，通常会添加一个末端半胱氨酸；它提供了一个巯基，可与马来酰亚胺活化的载体蛋白有效连接，并固定到碘乙酰活化的琼脂糖树脂（SulfoLink 耦合树脂）。

另一种常见的策略是使用胺基功能化的树脂和 EDC 交联剂，通过它们的氨基酸羧基（C-末端）固定肽段。因为肽具有氨基端和羧基端（也有可能是中间的赖氨酸、天冬氨酸或谷氨酸残基），EDC 引起的羧基-胺交联既能聚合肽，又能固定肽，从而使肽以多种方向与抗体进行亲和结合。这就是 GlycoLink 固定试剂盒的基础。

立即查看：马来酰亚胺激活的 KLH

除特殊情况外，在亲和抗体纯化中，蛋白抗原通常最容易通过靶向伯胺进行固定，伯胺通常存在于蛋白结构外表面的几个位点（即具有赖氨酸基团或亚基的N-末端的位点）。有几种高容量、 与胺反应的亲和支持物 可用于这种固定。

或者，如果该蛋白抗原是抗体纯化后的糖蛋白，并且碳水化合物基团不是相关的抗原表位，则该抗原可以经过高碘酸钠氧化之后，通过糖基团进行共价固定。这就是 GlycoLink 固定试剂盒的基础。

立即查看：NHS-活化琼脂糖
立即查看：AminoLink 固定化试剂盒

对于抗原特异性的抗体亲和纯化，常用的结合和洗脱条件并无差异，因为它们均基于抗体与各自抗原之间的天然亲和作用。也就是说，由于抗体被设计为在生理条件下识别和结合抗原，因此，大多数亲和抗体纯化步骤使用模拟生理 pH 和离子强度的结合条件。最常见的结合缓冲液是磷酸盐缓冲液 (PBS) 和 Tris 盐缓冲液（TBS），pH 为 7.2。一旦抗体与固定化抗原结合，就需要使用额外的结合缓冲液将支持物上未结合的蛋白洗脱下来。为减少非特异性结合，许多研究人员会使用含有额外盐分或洗涤剂的洗涤缓冲液，以破坏任何微弱的相互作用。

通过充分改变缓冲液的 pH 或离子浓度，破坏抗体与抗原结合的相互作用，就可以将纯化的抗体从亲和树脂上洗脱下来。大多数抗体是弹性适中的蛋白，能够承受 2.5-11.5 的 pH 范围而不会永久失活，而低pH洗脱法是目前最常用的策略。在某些情况下，抗体-抗原相互作用不能被pH值的变化有效破坏，或者会被pH值破坏，这就需要使用替代策略。

了解更多信息：亲和纯化概述（包括关于结合与洗脱缓冲液的讨论）

1. Grodzki, A.C. and Berenstein, E. (2010).Antibody purification: ammonium sulfate fractionation or gel filtration.In: C. Oliver and M.C.Jamur (eds.), Immunocytochemical Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology, Vol. 588:15–26.Humana Press.
2. Harlow, E. and Lane, D. (1988).抗体Anaerobe Laboratory Manual.Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York.Gagnon, P. (1996).
3. Gagnon, P.S.(1996).Purification Tools for Monoclonal Antibodies.Validated Biosystems.Tuscon, AZ.
4. Nethery, A., et al.(1990).J. Immunol.Method 126, 57–60.
5. Nevens, J.R., et al.(1992).J. Chromatogr.597, 247–256.
6. Roque-Barreira, M.C. and Campos-Neto, A. (1985).J. Immunol.Method 134(30), 1740–1743.
7. Aucouturier, P., et al.(1987).Mol.Immunol.24(5), 503–511.