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二抗介绍
二抗通过与一抗结合有助于检测、分选或纯化靶抗原，一抗可直接与靶抗原结合。由于大多数一抗仅在少数宿主动物物种中产生，且几乎所有的抗体均属于 IgG 类，因此生产商可轻松经济地生产和提供通常适用于大多数方法和检测系统的即用型二抗。针对不同的纯度级别、特异性和标记类型，无论何种应用，均有多种二抗可供选择。
二抗总结视频
观看此视频，了解使用二抗进行信号放大的相关信息
使用二抗的优势
二抗用于间接检测特异性一抗首先结合的靶标。二抗必须对抗体种类以及所用一抗的同种型均具有特异性。此外，二抗通常含有可检测标签或其他标记，便于检测或纯化。
使用二抗间接检测靶抗原所需的步骤多于使用一抗直接进行检测。然而，由于来自多个二抗与单一一抗结合的信号放大，间接检测的优势为增强了灵敏度。此外，给定的二抗可与同类型和宿主物种的任何一抗一起使用，这使其成为比单独标记的一抗更通用的试剂。针对常见物种一抗具有特异性的市售二抗已与多种常见标记物预偶联，包括荧光和酶偶联物可供选择。
在涉及使用特异性抗体进行的检测（例如免疫检测）中，直接和间接蛋白质检测的差异。 靶蛋白结合和固定的表面是膜（蛋白质印迹）或微板孔 （ELISA）。
除多样性、灵活性和多功能性外，使用二抗间接检测抗原还具有其他优势：
- 根据不同应用，允许使用相同的一抗和不同二抗
- 在某些情况下，相同的二抗可在各种应用（即荧光蛋白质印迹和免疫荧光）中用于验证靶抗原检测
- 二抗还能够在实验中进行多通路或多标记检测
了解更多信息：立即查看：二抗
二抗的特异性
二抗是宿主动物接种来自其他物种的抗体而产生的。例如， 抗小鼠二抗是通过向小鼠之外的其他动物注射接种小鼠抗体所产生的。山羊、驴和兔是生成二抗最常用的宿主物种，但也可使用其他宿主物种。
最常用的二抗类型都是通过接种靶标物种的一群免疫球蛋白而产生的。例如，采用纯化的小鼠 IgG 接种山羊，将会产生可以与所有种类的重链和轻链（H+L）、小鼠 IgG 片段以及其他共用同一保守结构域（例如，IgM 和 IgG 共用同一 kappa 轻链）的其他分子结合的山羊抗小鼠 IgG。相反，仅用小鼠 IgG1 抗体接种山羊，则仅产生靶向小鼠 IgG1 抗体及与其共用同一保守结构域的分子的抗体。
由于许多免疫球蛋白域结构具有高度保守性，区分特异性二抗必须经过亲和纯化和交叉吸附，从而最大限度减少与其他免疫球蛋白的交叉反应。上述实例证明，固定的小鼠 IgG1 抗体可用于亲和纯化所有与小鼠 IgG1 结合的山羊抗体。这类抗小鼠 IgG1 可通过含有小鼠 IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM 等的色谱柱去除任何与非 IgG1 同种型交叉反应的抗体，得到进一步纯化。
此外，还可通过含固定血清蛋白（来自于一抗物种之外的其他物种）的色谱柱，进一步纯化二抗。这种交叉吸附法（常称作 "高度交叉吸附"）是一种额外的纯化步骤，推荐用于使用多物种来源一抗以及待测样品中可能存在免疫球蛋白或其他血清蛋白的应用。
了解更多信息：二抗交叉吸附和交叉反应性
二抗规格
二抗有 3 种规格可供选择：
- 即用型液体
- 冻干
- 使用添加剂，如甘油
二抗规格取决于抗体的产生方式以及二抗提供者如何选择运输其产品。即用型液体二抗以浓缩液的形式提供，可能需要进行一些优化以确定其最佳工作条件。产品数据表中通常提供推荐的稀释度。即用型液体抗体浓缩液需在 4 至 8°C 之间储存，如果按照生产商的说明储存，可保持稳定长达一年。 即用型液体抗体可在 -20°C 或更低温度下分为等分试样储存，以延长其有效期。等分试样可随后进行解冻，并在使用前立即制备工作溶液。 由于重复冷冻和解冻会导致染色能力下降，因此建议将即用型二抗在 -20°C 温度下储存之前分为等分试样。
干燥冻干浓缩二抗储备品在使用前必须使用稀释剂复溶。虽然干燥小瓶冻干抗体可在– 20°C 或更低温度下保持稳定数年，但在复溶后必须像液体二抗一样处理。
甘油用作抗体储备液中的添加剂，可在 -80 至 -20°C 下储存期间延长其有效期。市售抗体中另一种常见添加剂为 BSA ，其用作稳定剂。由于抗体溶液的兼容性可能并非最初纯化和配制抗体时的关键考虑因素，因此必须考虑到抗体储备液中存在的添加剂，因为各种添加剂可能会对不同标记方法产生不同程度的影响。
选择二抗规格时需要考虑的特性总结如下：
| 即用型液体 | 冻干 | 含添加剂液体/冻干 |
|---|---|---|
| 液体二抗从小瓶中取出即可使用。 | 冻干二抗需在正确的缓冲液和 pH 条件下正确复溶。 | BSA、甘油等二抗添加剂可能会干扰靶标检测，具体情况取决于应用。 |
| 液体二抗可随时分为等分试样进行长期储存。 | 如果抗体未正确复溶，冻干二抗可能会出现性能或功能损失。 | 可能需在多种稀释度下检测含添加剂的二抗，以确保抗体与添加剂正确运行。 |
因此，您选择购买的二抗规格取决于多种因素，包括抗体购买地点、正在进行的实验类型或使用前的储存时间。Invitrogen 二抗以即用型液体规格提供，易于使用和储存。
了解更多信息：如何选择二抗
使用二抗
二抗可以标记偶联形式提供，也以 未偶联 形式提供。标记的选择取决于应用以及二抗检测方式。通过显色反应观察酶标记。常用酶包括辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶。HRP 底物更稳定，相对便宜。碱性磷酸酶提供更持久的信号（24 – 48 小时）以及比 HRP 更灵敏的比色检测。当需要信号放大同时检测低水平表达蛋白质时，使用亲和素-生物素系统。 与荧光染料偶联的二抗可提供更明亮的信号、多通路检测能力，易于使用。
Invitrogen 二抗偶联物包括：
由于二抗可与大量标记偶联，因此所用二抗类型最终取决于下游应用。
下表总结了在一些常见应用中使用的二抗类型：
仅供科研使用，不可用于诊断目的。