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SuperScript IV 反转录酶
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SuperScript IV 反转录酶是什么？
SuperScript IV 反转录酶是 Invitrogen SuperScript 系列的最新一代反转录酶。其为一种专有的 MMLV 突变体，具有更低的 RNase H 活性、更高的热稳定性以及高效合成全长 cDNA 的能力。与上一代 SuperScript 反转录酶相比，SuperScript IV 反转录酶的持续合成能力有了显著提升，即使对于具有挑战性的 RNA 样本，也能实现快速反应、高抑制剂耐受性和出色的性能。SuperScript IV 反转录酶有多种类型可供选择，适合特定的实验应用，并且在文献中被广泛引用。
SuperScript IV 反转录酶的优势
SuperScript IV 反转录酶因其具有高反应效率、高灵敏度、强劲扩增能力、缩短的反应时间和高热稳定性而闻名。点击下列属性以查看支持数据。
SuperScript IV 反转录酶：反应效率
一款高效的反转录酶可以转录低丰度 RNA 或已降解的 RNA。SuperScript IV 反转录酶非常强劲高效，当转录已降解的 RNA 时，cDNA 得率可达其他市售反转录酶的100倍（图1）。SuperScript IV 反转录酶是 cDNA 合成的上上之选，无论使用哪种类型的 RNA；即使对于已降解或样本量非常有限的 RNA，也可获得出色结果。
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图1.对于降解的 RNA 进行高效扩增。使用不同品牌的商业化反转录酶与 Applied Biosystems TaqMan Assay对来自人类细胞和植物组织的已降解 RNA (RIN 1–3) 进行 RT-qPCR。Delta Ct 值 (ΔCt = Ct – Ct SuperScript IV) 显示，SuperScript IV 反转录酶的 cDNA 得率相比 SuperScript III 和其他商业化反转录酶高达100倍，而且 Ct 值更低。
SuperScript IV 反转录酶：灵敏度
为了进行可靠的 cDNA 合成，反转录酶须具有较高的反应灵敏度和较低的变异性。 与其他反转录酶相比，SuperScript IV 反转录酶的 Ct 值减少了8个循环（图2）。针对三种不同起始量的已降解 RNA 进行三次重复 RT-qPCR 反应，结果显示 SuperScript IV 反转录酶的 Ct 值最低（减少了 8 个循环）。此外，RT-qPCR 结果的变异性也是最低，因此它可以提供出色的可重复性和可信度较高的实验结果。
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图2.使用已降解的 RNA 样本进行 cDNA 合成的灵敏度和变异性。根据产品实验方案，在用 SuperScript IV 反转录酶和随机六聚体进行的 20 μL 反转录反应中，将已降解的拟南芥总 RNA（RIN：1–3）用作起始 RNA，用量分别为1、10和 100 ng。来自其他供应商的反转录酶则根据各生产商推荐的实验方案予以使用。对于测试的每种酶和每个 RNA 起始量，均重复进行三次反转录反应。在每次反转录反应中，将 10% 的 cDNA 产物加入到 TaqMan Assay 中，针对两个靶标（Gln 合成酶和 WRKY TF 70）进行扩增。每个反转录反应进行三次 qPCR 反应，并绘制每个 RNA 起始量的平均 Ct 值（对于每个 RNA 起始量，与9个 Ct 值的标准偏差）。
SuperScript IV 反转录酶：抑制剂耐受性
即使使用彻底的RNA纯化方法，在RNA样本中仍然可能含有许多对反转录有抑制作用的化合物。这些化合物会干扰cDNA合成，导致错误的RT-PCR和RT-qPCR结果，从而对实验结果造成错误解读。反转录抑制剂包括RNA提取过程中使用的试剂，以及来自生物样本的共纯化污染物（表1）。与 Invitrogen SuperScript III和其它市售反转录酶相比，SuperScript IV反转录酶具有明显更好的抗抑制剂能力（图3）。
表 1.常见的 cDNA 合成抑制剂及其来源
| 抑制剂 | 来源 |
|---|---|
| 乙醇/异丙醇、盐、酚/氯仿、去垢剂 | 样本制备 |
| 血红素、胆盐 | 血液，粪便 |
| 腐植酸、多酚、多糖 | 土壤、植物 |
| 福尔马林、石蜡 | FFPE |
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图 3.在存在生物抑制剂或样本制备抑制剂的情况下，也能高效进行 cDNA 合成。根据实验方案，在含 oligo(dT)20 的 10 μL SuperScript IV 反转录反应中使用 0.5–10 kb RNA ladder 作为模板。同时使用其它供应商的反转录酶进行比较。在引物退火或加入反转录反应混合物之前，将抑制剂加入到 RNA 样本中。所获得的第一链 cDNA 通过碱性凝胶电泳分离，用 Invitrogen SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain对 cDNA 进行染色。在电泳过程中，NaOH 会水解所有 RNA，仅剩下 cDNA 可见。
SuperScript IV 反转录酶：反应时间
SuperScript IV反转录酶是一款具有极强合成能力的RNA反转录酶，可快速完成cDNA合成，获得全长cDNA片段。图4表明，SuperScript IV反转录酶可在10分钟内合成长达9 kb的cDNA，而大多数其他市售反转录酶只能在相同的时间内合成1.5-3 kb或更短的cDNA。
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图4.快速 cDNA 合成能力。根据实验方案，将 Invitrogen Millennium RNA Marker 加入含 oligo(dT) 的 10 μL SuperScript IV反转录反应体系中进行反转录。同时使用其它的反转录酶，反应时间均缩至 10 分钟。合成的第一链 cDNA 通过碱性凝胶电泳进行分离，然后用 SYBR Gold 核酸凝胶染料对 cDNA 进行染色。在电泳过程中，NaOH 会水解所有 RNA，仅剩下 cDNA 可见。
SuperScript IV 反转录酶：热稳定性
RNA 二级结构（尤其是富含 GC 的模板）会干扰 cDNA 的合成，尤其当在较低温度（低于42℃）下进行反应时。SuperScript IV反转录酶具有高热稳定性，可在 50℃ 或更高温度下进行反应，这有助于确保含复杂二级结构 RNA 模板的成功反转录（图5）。
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图 5.SuperScript IV 反转录酶的高热稳定性。根据实验方案，在含 oligo(dT) 的10 μL SuperScript IV 反应体系中对 0.5–10 kb RNA ladder 进行反转录，不同之处在于反应温度在 50℃ 和 65℃ 之间变化。合成的第一链 cDNA 通过碱性凝胶电泳进行分离，然后用 SYBR Gold 核酸凝胶染料对 cDNA 进行染色。在电泳过程中，NaOH 会水解所有 RNA，仅剩下 cDNA 可见。使用 TotalLab 软件对每个反应温度下的 cDNA 条带进行量化分析。使用每个反应温度下的值除以 50°C 下的值来计算 SuperScript IV 反转录酶的活性百分比。
SuperScript IV 反转录酶的种类：选择指南
SuperScript IV 反转录酶有多种类型可供选择，包括：
- 单酶—提供反转录酶与反应缓冲液
- 第一链 cDNA 合成系统—cDNA 合成所需的所有反应组分均以单管形式提供，以便灵活用于各种反应条件
- 预混液—cDNA 合成反应组分已预先混合，可在 RT-qPCR 实验中提供出色的效率和更低的变异性
- 一步法 RT-PCR 系统—用于一步法 RT-PCR 实验的反转录和 PCR 试剂
- 直接反转录—包括进行细胞裂解和 cDNA 合成的试剂；无需提取 RNA
| SuperScript IV 反转录酶 | SuperScript IV VILO 预混液 | SuperScript IV 第一链 cDNA 合成系统 | SuperScript IV 一步法 RT-PCR 系统 | SuperScript IV 单细胞/低起始量 cDNA 预扩增试剂盒 | SuperScript IV CellsDirect cDNA 合成试剂盒 | |
| 实验应用 | 对所有类型的 RNA 都能进行高效 cDNA 合成，包括难转录的模板 | 第一链 cDNA 合成反应预混液，用于两步法 RT-qPCR | 灵活应用于各种反应条件 | 快速、简单的 RT-PCR 实验流程 | 针对单细胞或少量 RNA 进行 cDNA 合成和预扩增 | 直接从哺乳动物细胞中合成 cDNA |
| 最佳反应温度 | 50–55°C | 50°C | 50–55°C | 50–55°C | 50°C | 50°C |
| 反应时间 | 10 min | 10 min | 10 min | 10 min | 10 min | 10 min |
| 可提供的规格 |
SuperScript IV 反转录酶与其他反转录酶的比较
单酶可在反应配制中提供最大的灵活性：
| M-MLV 反转录酶 | SuperScript II 反转录酶 | Superscript III 反转录酶 | Superscript IV 反转录酶 | |
| 关键属性 | 重组的 M-MLV 反转录酶，适合常规、要求不高的实验应用 | 基因工程改造的 M-MLV 反转录酶，RNase H 活性降低 | 基因工程改造的 M-MLV 反转录酶，具有更低的 RNase H 活性和更高的热稳定性 | 新一代基因工程改造的反转录酶，提供出色的 cDNA 合成性能 |
| 最佳反应温度 | 37°C | 42°C | 50°C | 50–55°C |
| 反应时间 | 50 min | 50 min | 30-50 min | 10 min |
| 灵敏度 | 1 ng | 1 ng | 10 pg | 10 pg |
| 最大 cDNA 合成长度 | 长达 7 kb | 长达 12.3 kb | 长达 12.3 kb | >12 kb |
| 处理已降解或含抑制剂 RNA 的能力 | 低 | 低 | 中 | 高 |
| 降低的 RNase H 活性 | 否 | 是 | 是 | 是 |
SuperScript IV 反转录酶相关资源
观看本视频，了解 SuperScript IV 反转录酶的优势。
了解 SuperScript IV 反转录酶如何在 qPCR 反应中始终保持低 Ct 值。
了解 SuperScript IV 反转录酶如何在有抑制剂的情况下同样表现出优异性能。
产品手册
实验方案
技术文章
SuperScript IV 反转录酶常见问答 (FAQ)
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SuperScript IV 酶经过基因工程改造，具有更高的热稳定性、持续合成能力和 cDNA 得率。在有抑制剂的情况下，它的性能更出色；反应缓冲液也经过优化，能够针对多种样本进行可靠的 cDNA 合成。
在合成 9 kb内 cDNA 的反应中，与 SuperScript III 反转录酶（或其他生产商的反转录酶）相比，SuperScript IV 反转录酶只需 10 分钟便能成功合成，并且得率相当（或更高）。
SuperScript IV 反转录酶在高达 56.4°C 的温度下可保持 100% 活性，在高达 65°C 的温度下可保持 70% 活性，而野生型 MMLV 反转录酶或 MMLV RNase H– 反转录酶在高于 45°C 时通常表现出非常低的活性或无活性。由于 SuperScript IV 反转录酶能够在较高的温度下发挥作用，所以它能反转录具有复杂结构的 RNA 靶标。
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