冷冻细胞

连续培养中的细胞系可能产生不良结果，如遗传漂变、衰老以及微生物污染，而且即使是运行状况最好的实验室也可能会出现设备故障。已建立的细胞系是一种宝贵的资源，并且其更换是昂贵且耗时的。因此，将其冷冻保存以用于长期储存至关重要。妥善维护的冷冻细胞储备液是细胞培养的重要组成部分。

一旦从传代培养中获得少量剩余细胞，理想的保存方法是将其冷冻作为种子储备液，并加以保护，并且不能用于一般实验室用途。可以使用冷冻种子储备液制备和补充工作储备液。如果种子储备液用尽，则可使用冻存的工作储备液制备新鲜种子储备液，其代数将比初始冷冻代数略微增加。

贴壁细胞和悬浮细胞的一般冷冻方法是相同的，但贴壁细胞需要在开始冷冻程序之前从培养板中取出。培养细胞的理想冻存方法是使用含二甲亚砜 (DMSO) 等冷冻保护剂的完全培养基冷冻细胞并将其保存于液氮中。冷冻保护剂可降低培养基的凝固点，同时可降低冷却速度，从而大大降低了晶体形成的风险，因为晶体会损伤细胞并导致细胞死亡。

冷冻培养基
应始终使用推荐的冷冻培养基进行细胞冻存。冷冻培养基应含有 DMSO 或甘油等冷冻保护剂。您也可以使用专门配制的冻存完全培养基，如 Gibco Recovery 细胞培养冷冻培养基或 Gibco Synth-a-Freeze 冻存培养基。

• Recovery 细胞培养冷冻培养基是一种适用于哺乳动物细胞培养的即用型冻存完全培养基，其胎牛血清和牛血清比例经过优化，可提高细胞存活率和解冻后的细胞复苏率。
• Synth-a-Freeze 冻存培养基是一种化学成分明确、不含蛋白质的无菌冻存培养基，含有 10% DMSO，适用于冻存除黑色素细胞以外的多种干细胞和原代细胞。

• 含对数生长期细胞的培养容器
• 完全生长培养基
• DMSO 等冷冻保护剂（细胞培养专用；仅在层流罩中打开）或冷冻培养基，如 Synth-a-Freeze 冻存培养基或 Recovery 细胞培养冷冻培养基
• 15 mL 或 50 mL 一次性无菌锥形管
• 用于确定活细胞和总细胞计数的试剂和设备（如 Invitrogen Countess II FL 自动细胞计数仪或血细胞计数器、细胞计数仪和台盼蓝）
• 无菌冻存管（即冻存管）
• 可控速度冷冻设备或异丙醇冻存盒
• 液氮储存容器

冻存贴壁细胞时，除以上材料外，您还需要：

• 平衡盐溶液，如 Gibco Dulbecco 磷酸盐缓冲液 (DPBS)，不含钙、镁或酚红
• 解离试剂，如胰蛋白酶或 Gibco TrypLE Express，不含酚红

以下方案描述了冻存培养细胞的通用步骤。具体方案，请始终参阅细胞特定产品说明书。

1. 制备冷冻培养基并保存于 2-8°C 备用。请注意选择适用于细胞系的冷冻培养基。
2. 冻存贴壁细胞时，应按照细胞传代时采用的方法将细胞从组织培养容器上温和解离下来。将解离细胞重悬于适用于该细胞类型的完全培养基中。
3. 利用血细胞计数器、细胞计数仪和台盼蓝拒染法或 Countess 自动细胞计数仪测定细胞总数和活细胞百分比。根据目标存活细胞密度，计算所需冷冻培养基体积。

4. 以约 100–200 × g 离心细胞悬液 5-10 分钟。在不扰动细胞团块的情况下，无菌倾析上清液。

   注：  细胞类型不同，离心速度和时间也不同。

5. 按照特定细胞类型的推荐活细胞密度，将细胞团块重悬于冷却的冷冻培养基中。
6. 将细胞悬液分装于冻存管中。分装时，应经常轻轻混合细胞，维持细胞悬液的均一性。
7. 在可控速度冷冻设备中冷冻细胞，降温速度约为 1°C/分钟。或者，将装有细胞的冻存管放在异丙醇冻存盒中，并将其保存于 –80°C 过夜。
8. 将冻存细胞转移至液氮，将其放在液氮上方的气相中。

遵循以下指南对于冻存细胞系以供未来使用非常重要。与其他细胞培养操作相同，我们建议您严格遵守细胞系随附的使用说明，以获得最佳结果。

• 尽可能冻存高浓度、低代数的细胞样本。应保证细胞在冻存前至少存活 90%。应注意，所用细胞系不同，最佳冻存条件也不同。
• 使用可控速度冻存冰箱或冻存容器，如 Thermo Scientific Nalgene 实验室器具 (Nalge Nunc) 的“Mr. Frosty”，以约 1°C/分钟的降温速度缓慢冷冻细胞。
• 应始终使用推荐的冷冻培养基。冷冻培养基应含有冷冻保护剂，如 DMSO 或甘油（参见什么是传代培养？）
• 细胞样本应储存在低于 -135°C 的气相液氮中。
• 应始终使用无菌冻存管保存冷冻细胞。装有冷冻细胞的冻存管应完全浸没于液氮中或液氮上方的气相中（参见以下安全说明）。
• 应始终穿戴个人防护设备。
• 与细胞直接接触的所有溶液和设备都必须无菌。始终使用适当的无菌技术，并在层流罩中进行操作。