贴壁细胞传代

以下步骤描述了贴壁培养哺乳动物细胞传代的一般流程。请注意昆虫细胞与哺乳动物细胞传代的一些关键步骤有所不同。有关详细信息，请参阅昆虫细胞传代培养注意事项。

要传代您自己的细胞系，我们建议您严格按照实验中使用的每种产品随附的说明进行传代。偏离特定细胞类型所需的培养条件可能导致表达异常表型，甚至细胞培养完全失败。

• 含有贴壁细胞的培养容器
• 组织培养处理过的培养瓶、培养板或培养皿
• 完全生长培养基，预热至 37°C
• 15 mL 一次性无菌管
• 含 5% CO₂ 湿润空气的 37°C 培养箱
• 平衡盐溶液，如 Dulbecco 磷酸盐缓冲液 (DPBS)，不含钙、镁或酚红
• 解离试剂，如胰蛋白酶或 Gibco TrypLE Express，不含酚红
• 用于确定活细胞和总细胞计数的试剂和设备（例如 Countess II FL 自动细胞计数仪、台盼蓝和血细胞计数器或 Coulter Counter^® (Beckman Coulter)）

与细胞直接接触的所有溶液和设备都必须无菌。始终使用适当的无菌技术，并在生物安全柜中进行操作。

1. 从培养容器中取出并丢弃用过的细胞培养基。
2. 用不含钙和镁的平衡盐溶液清洗细胞（每 10 cm₂ 培养表面积约 2 mL）。向培养容器附着细胞层的对侧缓慢添加洗涤液，以避免干扰细胞层，并来回摇动数次培养容器。

3. 从培养容器中取出并丢弃洗涤液
4. 将预热的解离试剂（如胰蛋白酶或 TrypLE）添加到培养瓶一侧；使用足够的试剂覆盖细胞层（每 10 cm₂ 约 0.5 mL）。轻轻晃动容器，以完全覆盖细胞层。
5. 室温孵育培养容器约2分钟。请注意，实际孵育时间因使用的细胞系而异。
6. 在显微镜下观察细胞是否解离。如果细胞解离率低于 90%，则将孵育时间延长几分钟，每30秒检查一次分离情况。您也可以轻敲容器以加快细胞解离。
7. 当≥ 90%的细胞已解离时，倾斜培养容器一小段时间，使细胞排出。加入相当于2倍体积（所用解离试剂体积的两倍）的预热完全生长培养基。通过几次移液，从细胞层表面分离培养基。
8. 将细胞转移至 15 mL 锥形管中，然后以 200 × g 离心 5-10 分钟。请注意，离心速度和时间因细胞类型而异。
9. 将细胞团块重悬于最小体积的预热完全生长培养基中，并取出样本进行计数。
10. 利用血细胞计数器、细胞计数仪和台盼蓝拒染法或 Invitrogen Countess 自动细胞计数仪测定细胞总数和活细胞百分比。如有必要，向细胞中加入生长培养基，以达到所需的细胞浓度，并重新进行细胞计数。

11. 将细胞悬浮液稀释至细胞系的推荐接种密度，并将适当体积的细胞移液至新的细胞培养容器中，然后将细胞放回培养箱。

尽管昆虫细胞传代培养的一般步骤与哺乳动物细胞相同，但这些培养体系的一些关键要求不尽相同。为获得最佳结果，请务必按照您实验中使用的每种贴壁细胞产品随附的说明进行操作。

• 昆虫细胞在对数期传代。然而，如果您的昆虫细胞贴壁能力很强，您可在其达到汇合状态或刚刚脱离培养瓶底部时进行传代，此时细胞将更容易脱落。
• 细胞密度低于汇合状态的 20% 时，生长会受到抑制。最健康的细胞是取自对数期培养物中的细胞。
• 不建议在昆虫细胞培养中进行 CO₂ 交换。
• 将昆虫细胞保存在 27°C 的非湿润环境中。可将细胞避光保存在室温条件下的试验台上或抽屉里。但是，还是推荐27°C的受控环境进行培养。
• 使用专门为昆虫细胞生长配制的培养基。
• 在无血清条件下，昆虫细胞非常紧密地附着在基质上，需要额外的力才能解离。要使这些细胞脱离，您可能需要借助手腕的快速运动来摇动培养瓶。为避免污染，在执行此步骤前请务必拧紧瓶盖。

注意：我们不建议剧烈摇动培养瓶，因为这可能会导致细胞损伤。