介绍

以下方案描述了在哺乳动物悬浮细胞传达的一般步骤。请注意，昆虫细胞的传代程序与哺乳动物细胞的传代程序在几个关键步骤上有所不同。有关详细信息，请参阅传代培养昆虫细胞的传代注意事项。

要传代您自己的细胞系，我们建议您严格按照实验中使用的每种产品随附的说明进行传代。偏离特定细胞类型所需的培养条件可能导致表达异常表型，甚至细胞培养完全失败。

传代悬浮培养
悬浮细胞比贴壁细胞传代稍微简单一些。由于细胞已经悬浮在生长培养基中，无需通过酶促处理将其从培养容器表面解离，整个过程更快，且对细胞的损伤更小。在悬浮培养中不进行生长培养基的更换；而是通过每2至3天向细胞加料一次来维持培养，直到细胞达到汇合状态。这可以通过以下方式来实现：直接在培养瓶中稀释细胞并继续扩增，或从培养瓶中取出一部分细胞，然后将剩余的细胞稀释至适合该细胞系的接种密度。通常，传代后的延滞期比贴壁培养所观察到的更短。

悬浮培养容器
悬浮培养物可在未经组织培养处理的无菌培养瓶（如无挡板的摇瓶）中维持培养；然而，专门设计用于悬浮细胞培养的转瓶（即搅拌瓶）可进行更好的气体交换，能够培养更大量的细胞。

转瓶有两种基本设计；通过悬挂搅拌棒组件或垂直叶轮搅动（即搅拌）培养基。垂直叶轮可提供更好的通气。为了适当通气，转瓶中的总培养体积不应超过转瓶指定体积的一半（例如，500 mL 转瓶中所含培养物不得超过 250 mL）。

材料

  • 含有悬浮细胞的培养容器
  • 无挡板摇瓶或转瓶（参见悬浮培养容器）
  • 完全生长培养基，预热至 37°C
  • 含 5% CO2 湿润空气的 37°C 培养箱
  • 磁力搅拌板（如果使用转瓶）、滚瓶架（如果使用滚瓶）或摇床（如果使用传统的培养瓶或皮氏培养皿）
  • 用于确定活细胞和总细胞计数的试剂和设备（例如 Invitrogen Countess II FL 自动细胞计数仪、台盼蓝和血细胞计数器或 Coulter Counter®）

悬浮细胞传代方案

视频：细胞传代

本视频解释了为什么、何时以及如何在贴壁培养物和悬浮培养物中传代细胞。这包括细胞解离、细胞计数、确定最佳接种密度和为传代细胞准备新的培养容器。

与细胞直接接触的所有溶液和设备都必须无菌。
始终使用适当的无菌技术，并在层流罩中进行操作。在细胞达到汇合之前处于对数期生长时进行传代。达到汇合状态时，悬浮细胞会聚集成团块，涡旋培养瓶时，培养基会变得浑浊。推荐的传代前最大细胞密度因细胞系而异；有关详细信息，请参阅细胞特定产品说明书或手册。

在摇瓶中生长的细胞
以下方案描述了在摇床培养箱中使用摇瓶对悬浮培养物中生长的哺乳动物细胞进行传代的通用步骤。具体方案，请始终参阅细胞特定产品说明书。

 

注：确保摇瓶没有挡板（即，摇瓶底部设计用于搅拌的凹痕），因为它们会破坏振摇节律。

  1. 当细胞准备好进行传代（即处于达到汇合状态之前的对数生长期）时，请从培养箱中取出培养瓶并使用无菌移液器从培养瓶中取出少量样本。如果细胞在取样前已经沉淀，则旋转培养瓶使细胞均匀分布在培养基中。
  2. 使用 Countess 自动细胞计数仪或血细胞计数器、细胞计数仪和台盼蓝拒染法，测定样本中的细胞总数和活细胞百分比。
  3. 计算您需要添加的培养基的量，以将培养物稀释到建议的接种密度。
  4. 在无菌条件下将适量的预热生长培养基添加到培养瓶中。如需要，您可以将培养物分为若干小份，加入多个培养瓶。
  5. 将培养瓶的盖子拧松一整圈，以便进行适当的气体交换（或使用透气盖），然后将培养瓶放回摇床培养箱中。振荡速度取决于细胞系。

注：为尽量减少细胞碎片和代谢废物副产物在摇床培养物中积累，以 100 × g 轻轻离心细胞悬液 5-10 分钟，并将细胞团块重悬于新鲜的生长培养基中，每三周一次（或根据需要）。

在转瓶中生长的细胞
以下方案描述了使用转瓶对悬浮生长的哺乳动物细胞进行传代的通用步骤。具体方案，请始终参阅细胞特定产品说明书。

请注意，细胞对物理剪切敏感。确保叶轮机构自由旋转，且不接触容器壁或底部。叶片顶部应略高于培养基，以确保培养物充分通气。调整旋转器机制，使叶片远离容器的侧面和底部。下表列出了不同转瓶规格所需的最少培养基用量。 
转瓶规格
最低培养基用量
100 mL
30 mL
250 mL
80 mL
500 mL
200 mL

我们不建议直接在大于500 mL的转瓶中直接开始旋转培养。我们建议从已经验证的小体积转瓶开始逐步扩大培养规模。

  1. 当细胞准备好进行传代（即处于达到汇合状态之前的对数生长期）时，请从培养箱中取出培养瓶并使用无菌移液器从培养瓶中取出少量样本。如果细胞在取样前已沉淀，则涡旋培养瓶以使细胞在培养基中均匀分布。
  2. 使用 Countess 自动细胞计数仪或血细胞计数器、细胞计数仪和台盼蓝拒染法，测定样本中的细胞总数和活细胞百分比。
  3. 计算您需要添加的培养基的量，以将培养物稀释到建议的接种密度。
  4. 在无菌条件下将适量的预热生长培养基添加到培养瓶中。如有需要，可将培养物分装至多个培养瓶中。
  5. 将转瓶的侧臂盖拧松一整圈，以便进行适当的气体交换，然后将转瓶放回培养箱中。旋转速度取决于细胞系和叶轮类型。确保旋转速度保持在推荐值范围内，以避免因剪切应力损坏细胞。

注：为尽量减少细胞碎片和代谢废物副产物在转瓶培养物中积累，以 100 × g 轻轻离心细胞悬液 5-10 分钟，并将细胞团块重悬于新鲜的生长培养基中，每三周一次（或根据需要）。

悬浮昆虫细胞传代培养说明

虽然传代培养昆虫细胞的通用步骤与哺乳动物细胞相同，但这些培养系统的一些关键要求是不同的。为获得最佳结果，请务必按照您实验中使用的昆虫细胞系随附的说明进行操作。

  • 在悬液中培养细胞时，无需更换培养基。常规传代培养需要去除细胞悬液，加入足量培养基以将培养物稀释至适当密度（请参阅细胞特定产品说明书）。加入新鲜的培养基足以补充细胞营养物质。
  • 不建议在昆虫细胞培养中进行 CO2 交换。
  • 将昆虫细胞保存在 27°C 非湿化环境中。细胞可以在室温下保存在工作台上或抽屉中，但是，推荐将操作温度控制在27°C左右。
  • 使用专门为昆虫细胞生长配制的培养基。
  • 使用表面活性剂可减少剪切。旋转昆虫培养推荐使用 0.1% Invitrogen Pluronic F-68。Pluronic F-68 (BASF) 是一种表面活性剂，它可以减少由于叶轮作用力对细胞膜造成的剪切力损伤。

    注：Sf-900 II SFM 和 Gibco Express Five SFM 已经含有表面活性剂。

  • 某些昆虫细胞系可能需要适应悬浮培养。有关详细信息，请参阅细胞系特定产品说明书或手册。

仅供科研使用，不可用于诊断目的。