从 AlgiMatrix 试剂中分离活球状体

• 1M 柠檬酸三钠 29.41 g/100 ml
• 1M 柠檬酸 19.213 g/100 ml
• 100 g/L 氯化钠
  

使用柠檬酸三钠分离球状体

1. 从 AlgiMatrix 微孔板的孔中吸出培养基
2. 向每孔添加 200 µl 不完全培养基并在 37°C 下孵育5分钟
3. 将6份海绵转移至 15 ml 锥形离心管中
4. 加入 6 ml（1 ml/海绵）等渗 55 mM 柠檬酸三钠溶液
5. 通过上下颠倒轻柔混匀，在室温下孵育离心管 4-5 分钟
6. 在 25°C 下以 200 x g 的设置离心试管7分钟，弃去上清液
7. 将球状体沉淀物重悬于完全培养基中，以供进一步使用

制备等渗柠檬酸三钠溶液

1. 用 1M 储备液制备 55 mM 柠檬酸三钠溶液
2. 用 100 g/L NaCl 溶液将柠檬酸盐溶液的渗透压调节至与培养基相同。（向溶液中添加 1 g/L NaCl 可将渗透压升高 30 mOsm）
3. 用 1M 柠檬酸溶液将 pH 值调节至 pH 7.2

计算复合溶液的渗透压：

正如在“测量单位”中所述，简单溶液的渗透压等于摩尔浓度乘以每个分子的粒子数。

葡萄糖有1个粒子
NaCl 有2个粒子
MgCl₂ 有3个粒子
柠檬酸三钠有4个粒子 (HOC(COONa)(CH₂COONa)₂)

备注：55 mM 柠檬酸三钠溶液的渗透压为 220 mOsm，如果在 DMEM 中培养细胞（DMEM 渗透压范围为 322-374），则将此溶液的渗透压调节为 340 mOsm。

使用 Versene 分离球状体

1. 从 AlgiMatrix 微孔板的孔中吸出培养基
2. 向每孔添加 200 µl 不完全培养基并在 37°C 下孵育5分钟
3. 将5份海绵转移至 15 ml 锥形离心管中
4. 在含有5份海绵的离心管中加入 10 ml Versene，并在 37°C 条件下置于倒置装置上25分钟
5. 在 25°C 下以 200 x g 的设置离心试管7分钟，移除上清液
6. 将球状体沉淀物重悬于完全培养基中，以供进一步使用

使用台盼蓝染色排除法对球状体进行活力研究

1. 将等体积的球状体悬液与2倍体积的台盼蓝染料混合
2. 将混合物置于玻璃载玻片上
3. 在相差显微镜下观察球状体的活力