适用于 HT 检测的 SKOV-3 细胞系球状体的生成和表征

从液氮中解冻后，将细胞维持培养在 Nunclon Delta T25 细胞培养瓶内添加了 10% Gibco FBS 和 1% Pen-Strep 的 Gibco McCoy’s 5A 培养基中，经1次传代后接种用于生成球状体。然后遵循 ATCC 实验方案进行传代培养。

• Nunclon Sphera 96孔板
• 完全培养基（添加了 10% FBS 和 1% Pen-Strep 的 Gibco McCoy’s 5A 培养基）
• 1X PBS
• TrypLE 试剂
• 配有旋转吊篮转头和96孔板支架的离心机
• Countess II 细胞计数仪或血细胞计数器
• 15/50 ml 离心管
• 多通道移液器
• 无菌试剂加样槽

1. 在实验当天，从培养瓶中吸出培养基，在 1X PBS 中洗涤细胞一次，然后用 1–1.5 ml TrypLE 试剂解离。
2. 使用4倍体积的完全培养基中和 TrypLE 试剂，并使用 Countess II 细胞计数舱室采集活细胞计数和活力。采集活力达到 >90% 的细胞用于生成球状体。
3. 在完全培养基中对细胞储备液进行 1:10 至 1:20 稀释，以更容易计算细胞接种密度。
4. 使用细胞接种计算器计算接种细胞数。
5. 使用多通道移液器将所需数量的细胞接种到 Nunclon Sphera 微孔板各自的孔中。最终体积保持在 100 μl。
6. 将微孔板以 250 g 的设置离心5分钟，然后置于培养箱中。此为第0天。
7. 球状体在第1天（18–24 小时）准备就绪。

跳转至细胞活力 LIVE/DEAD 可视化实验方案

• 与第0天相比，第1天的细胞聚集体显著压实。
• 与第1天相比，第3天聚集体进一步压实且细胞死亡增加。
• 第3天之后，球状体的压实减弱。
• <5,000 和 >10,000 的细胞接种密度不会形成良好的球状体。

接种 2,500–20,000 个 SKOV-3 细胞用于生成球状体，并在第0天、第1天和第3天使用 EVOS M7000 显微镜在4倍放大倍率下采集球状体的明场图像。比例尺为 650 μm。

1. 使用 LIVE/DEAD 活力/细胞毒性检测试剂盒中的试剂进行染色，以显现第1天和第3天 SKOV-3 球状体中的活细胞和死细胞群。
2. 在 1X PBS 中加入最终浓度均为 2 μM 的钙黄绿素 AM 和 EthD-1，制得工作溶液。（参见应用文档了解关于球状体荧光染色的更多信息）。
3. 向工作溶液中添加 NucBlue Live ReadyProbes 试剂（2滴/ml），用于球状体核染色。然后向含 100 μl 用后培养基的96孔板各孔中加入 100 μl 此工作溶液。然后将孔板置于 37°C 孵育3小时。
4. 之后，将微孔板在室温下以 250 g 的设置离心5分钟，将培养基按 1:1 比例更换为 PBS 并再次离心，以在荧光成像过程中尽量减弱背景。
5. 使用 CellInsight CX7 高内涵筛选平台在 4X 物镜下捕获荧光图像。每幅图像的最大强度投影为10 μm z 轴层扫（15–25 层扫，具体取决于球状体尺寸）。

备注：随着球状体直径增大，染料渗透率下降，并且死细胞群扩大（红色染色）。